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Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13798 (2022) Citar este artículo

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La leucoféresis, la separación extracorpórea de los glóbulos blancos (WBC) de los glóbulos rojos (RBC) y las plaquetas (PLT), es un procedimiento que salva vidas y se usa para tratar a pacientes con cáncer y otras afecciones, y como paso inicial en la fabricación de terapias celulares y basadas en genes. Bien tolerada por los adultos, la leucaféresis presenta un riesgo significativo para los recién nacidos y los bebés de bajo peso porque el volumen extracorpóreo (ECV) de las máquinas estándar basadas en centrifugación representa una fracción particularmente grande del volumen total de sangre de estos pacientes. Aquí describimos un novedoso dispositivo de microfluidos de alto rendimiento (con un volumen vacío de 0,4 ml) basado en tecnología de filtración incremental controlada (CIF) que podría reemplazar la centrifugación para realizar leucaféresis. El dispositivo CIF se probó extensamente con sangre total de voluntarios sanos en múltiples hematocritos (5–30 %) y velocidades de flujo (10–30 ml/min). En el régimen de flujo continuo, el dispositivo CIF separó los glóbulos blancos con una eficiencia > 85 % y una pérdida de glóbulos rojos y plaquetas del 10 al 15 % mientras procesaba sangre total diluida con solución salina al 10 % de hematocrito a una velocidad de flujo de 10 ml/min. En el régimen de recirculación, el dispositivo CIF demostró un nivel similar de rendimiento de separación, prácticamente agotando los glóbulos blancos en la sangre recirculante (reducción de ~ 98 %) al final de un procedimiento de leucoaféresis simulado de 3,5 horas. Es importante destacar que el dispositivo funcionó sin obstrucciones ni disminución en el rendimiento de separación, con una activación mínima de WBC y PLT y ningún daño medible a los RBC. En comparación con los parámetros típicos de la leucoféresis basada en centrifugación, el dispositivo CIF tenía un volumen vacío al menos 100 veces más pequeño, eliminaba los glóbulos blancos aproximadamente el doble de rápido y perdía ~ 2 o 3 veces menos PLT, mientras operaba a un caudal compatible con la práctica actual. El hematocrito y la tasa de flujo a los que operaba el dispositivo CIF eran significativamente más altos que los publicados anteriormente para otros métodos de separación de células por microfluidos. Finalmente, este estudio es el primero en demostrar una separación altamente eficiente de las células de la sangre recirculante utilizando un dispositivo de microfluidos. En general, estos hallazgos sugieren la viabilidad de utilizar tecnología de separación de células microfluídicas de alto rendimiento para, en última instancia, permitir la leucoféresis de bajo ECV y sin centrifugación. Tal capacidad sería particularmente útil en niños pequeños, un grupo vulnerable de pacientes que actualmente están desatendidos.

La leucoféresis es un procedimiento médico complejo durante el cual la sangre de un paciente pasa a través de una máquina de aféresis para recolectar glóbulos blancos (WBC) y devolver glóbulos rojos (RBC) y plaquetas (PLT) al paciente1,2. La leucoféresis permite dos aplicaciones que pueden salvar vidas: la leucodepleción y la recolección de glóbulos blancos. La leucodepleción se puede utilizar para reducir un recuento de glóbulos blancos peligrosamente alto en pacientes con leucemia3,4, o para eliminar los glóbulos blancos activados como tratamiento sin fármacos para la enfermedad inflamatoria intestinal5,6,7 y otras afecciones8,9. La recolección de glóbulos blancos mediante leucaféresis es el paso inicial en la fabricación de una amplia gama de terapias celulares2, incluida la infusión de granulocitos10,11, inmunoterapias adoptivas12,13,14,15, trasplante de células madre hematopoyéticas16,17,18 y nuevos tratamientos basados en genes19,20 .

Aunque generalmente los adultos y los niños mayores lo toleran bien, realizar leucaféresis en recién nacidos y bebés de bajo peso es técnicamente desafiante y clínicamente riesgoso. Actualmente, la leucoféresis se realiza utilizando máquinas de aféresis basadas en centrifugación, que tienen un volumen extracorpóreo (ECV) sustancial que generalmente oscila entre 150 y 250 ml (excluyendo cualquier tubo adicional para conectar al paciente)2,21, mientras que el volumen de sangre total (TBV) de un lactante de 10 kg solo pesa ~ 750 mL22,23. Debido a que el ECV representa una fracción tan grande de su TBV, los pacientes pediátricos experimentan una incidencia significativamente mayor de complicaciones graves asociadas con el procedimiento de leucaféresis, que incluyen hipotensión, hipocalcemia sintomática, reacciones alérgicas, trombosis relacionada con el catéter, infecciones, anemia grave e incluso la muerte21 ,24,25,26,27,28. En principio, los glóbulos blancos también se pueden separar utilizando un filtro de leucorreducción normal29,30 o una columna llena de perlas de acetato de celulosa que adsorbe selectivamente los granulocitos y monocitos activados6. Sin embargo, la capacidad de separación de estos dispositivos está limitada por su tamaño físico, los glóbulos blancos atrapados por los dispositivos continúan liberando citocinas proinflamatorias en el torrente sanguíneo y la recuperación de los glóbulos blancos atrapados mediante retrolavado es bastante modesta6,29,30.

El primer intento de miniaturizar la leucoféresis mediante microfluídica utilizó un filtro de difusión de flujo continuo para eliminar los glóbulos blancos de una muestra de sangre con alta eficiencia (~ 97 %), aunque con una pérdida significativa de glóbulos rojos (~ 50 %) y una tasa de flujo de solo 5 µL/min31. Desde entonces, el uso de tecnologías microfluídicas para la separación de células sanguíneas (aunque no específicamente para la leucoaféresis) ha aumentado constantemente32. Los dispositivos basados en el 'enfoque inercial'33,34 pueden realizar la separación celular a velocidades de flujo relativamente altas (1–20 ml/min) pero requieren una dilución significativa de la muestra de sangre (< 1 % de hematocrito, HCT)35,36,37. Los dispositivos basados en el 'desplazamiento lateral determinista' (DLD)38 requieren una dilución significativamente menor, pero tienen tamaños mínimos de características extremadamente pequeños (< 5 µm), requieren múltiples bombas y presiones de conducción extremadamente altas para operar a velocidades de flujo razonables (< 7 mL/min ) y, a menudo, someten a las células a una tensión de cizallamiento lo suficientemente alta como para activar la PLT y el factor de von Willebrand39,40,41,42. La 'filtración incremental controlada' (CIF) superó estas limitaciones al tener un tamaño de característica mínimo sustancialmente mayor (~ 20 µm) y, por lo tanto, redujo la resistencia a los fluidos y el cizallamiento en todo el dispositivo43,44. Como resultado, un dispositivo basado en CIF pudo separar > 85 % de los WBC (con < 30 % de pérdida de RBC y PLT) de los concentrados de células mononucleares (MNC) (~ 5 % HCT) a velocidades de flujo de hasta 30 mL/min46 y las PLT concentradas y leucorreducidas mediante CIF se activaron mínimamente43,44. A pesar de estos importantes avances, ninguno de los dispositivos antes mencionados se ha probado en el régimen de recirculación durante un período de tiempo significativo, y los efectos de dicho procesamiento en las células sanguíneas y el rendimiento del dispositivo aún se desconocen en gran medida.

En este estudio, describimos un nuevo dispositivo basado en CIF con un volumen vacío de solo 0,4 ml diseñado para la separación de alto rendimiento de glóbulos blancos de sangre completa recirculante mínimamente diluida. Primero probamos el rendimiento de separación del dispositivo en un régimen de flujo continuo mientras ajustamos múltiples variables de forma independiente: HCT (5–30 %), proporción de flujo de filtrado:retenido (2–13:1) y velocidad de flujo (10–30 ml). /min). El dispositivo demostró una eficacia superior al 85 % en la eliminación de glóbulos blancos (con una pérdida de glóbulos rojos y plaquetas solo del 10 al 15 %) mientras procesaba sangre completa diluida con HCT al 10 % a un caudal de 10 ml/min. Cuando se probó en el régimen de recirculación, el dispositivo funcionó sin obstrucciones ni disminución en el rendimiento de la separación, con una activación mínima de WBC y PLT y ningún daño medible a los RBC durante toda la duración de un procedimiento de leucoaféresis simulado de 3,5 horas. La concentración de WBC en la sangre recirculante disminuyó exponencialmente, disminuyendo ~ 98 % al final del procedimiento.

El principio operativo de la filtración incremental controlada (CIF) y el marco computacional utilizado para generar diseños de dispositivos basados en CIF se han descrito en detalle anteriormente43,44. Un diseño CIF típico consta de tres canales de flujo colineales separados por una serie de postes en forma de 'píldora', que definen los espacios de filtración que conectan los canales central y lateral de manera fluida (Fig. 1). A medida que la muestra de sangre fluye a través del canal central, una pequeña fracción de ese flujo se desvía hacia los canales laterales a través de cada espacio de filtración. El ancho de los canales laterales aumenta gradualmente para adaptarse a la entrada de filtrado. La tasa de este aumento se calcula, como se describió anteriormente43, para controlar con precisión la fracción de flujo extraído a través de cada brecha. Es la magnitud de esta fracción de flujo, no el ancho de los espacios, lo que determina el límite de tamaño para las celdas que son demasiado grandes para ser arrastradas hacia los canales laterales por el filtrado ("diámetro crítico"). El diámetro crítico del diseño CIF utilizado en este estudio fue de 6 µm para retener la mayoría de los glóbulos blancos en el canal central y permitir que los glóbulos rojos y las PLT fluyan hacia los canales laterales sin obstáculos (Fig. 1). Debido a que la fracción de flujo extraída a través de cada espacio es relativamente pequeña, cualquier diseño CIF debe incorporar miles de espacios para lograr la relación de flujo de filtrado:retenido deseada43,44. En la práctica, el número de espacios de filtración (y, por lo tanto, la relación de flujo) está limitado por la longitud máxima del canal permitida por la técnica de fabricación44,46.

La separación de WBC de RBC y PLT mediante filtración incremental controlada (CIF). La mayoría de los glóbulos blancos son demasiado grandes para que el filtrado los arrastre hacia los canales laterales y, por lo tanto, se retienen y concentran en el canal central. Los RBC y las PLT son más pequeños que el diámetro crítico del dispositivo y, por lo tanto, se distribuyen entre el filtrado y el retenido de acuerdo con la relación de flujo del dispositivo.

El dispositivo CIF comprendía una matriz de 48 elementos CIF individuales multiplexados en paralelo (Fig. 2). Cada elemento CIF tenía una huella total de 1,4 mm × 73 mm y consistía en (Fig. 2a): (i) un filtro incorporado para retener microagregados y otros desechos que pueden estar presentes en la muestra de sangre, (ii) una transición región donde cada canal lateral constaba de una serie de segmentos serpenteantes progresivamente más cortos para garantizar que se extrajera la fracción de flujo adecuada mientras se mantenía el tamaño mínimo de la característica en ~ 20 µm44, y (iii) una región de separación lineal (~ 61 mm de largo) en la que el ancho de los canales laterales aumentó progresivamente y el ancho del canal central disminuyó en toda su longitud. Una serie de orificios pasantes en la capa del dispositivo proporcionó acceso fluídico a la entrada común y las salidas de todos los elementos CIF. Las salidas de los canales centrales se recolectaron a través de una red de grandes canales en la capa superior separada (Fig. 2b). Un dispositivo CIF completamente ensamblado tenía una entrada a través de la cual se distribuía la muestra de sangre a cada elemento CIF del dispositivo, y dos salidas para recolectar las salidas de los canales centrales (retenido) y canales laterales (filtrado) de todos los elementos CIF (Fig. 2c). El volumen vacío del dispositivo CIF multiplexado fue de 0,4 ml, excluyendo el tubo (Fig. 2c).

Dispositivo microfluídico basado en CIF. (a) Diseño del elemento CIF. Ancho del canal lateral cerca de la entrada ws(in) = 21 µm y cerca de la salida ws(out) = 154 µm. Ancho del canal central cerca de la entrada wc(in) = 120 µm y cerca de la salida wc(out) = 70 µm. Ancho del espacio de filtración g = 19 µm. La profundidad de todos los canales es de 140 µm. (b) Componentes del dispositivo CIF multiplexado: (i) una 'capa superior' que contiene un sistema de canales más grandes para recolectar la salida del canal central (retenido) de cada elemento CIF del dispositivo, (ii) una 'capa de dispositivo' que consiste de elementos CIF individuales dispuestos en paralelo, y (iii) un sustrato plano para sellar los canales del dispositivo. (c) Un dispositivo de microfluidos ensamblado compuesto por 48 elementos CIF multiplexados llenos de una muestra de sangre HCT al 10 %. La barra de escala es de 1 cm.

Primero probamos el efecto de la muestra HCT en el rendimiento del dispositivo CIF. La eficiencia de eliminación de WBC fue la más alta (88,4 ± 1,3 %) para la muestra con 10 % de HCT y disminuyó a medida que aumentaba el HCT de la muestra (Fig. 3a). Para muestras con 20 % de HCT, el dispositivo CIF pudo eliminar el 57 ± 7 % de los glóbulos blancos inicialmente presentes en la sangre que pasaba por el dispositivo. El porcentaje de eliminación (pérdida) de RBC y PLT aumentó modestamente con el aumento de HCT, de 10,6 ± 0,9 % para RBC y 9,1 ± 0,5 % para PLT al 5 % de HCT a 14,8 ± 0,1 % para RBC y 14,1 ± 0,5 % para PLT a los 30 % HCT (Fig. 3a). Como se esperaba para las células que son más pequeñas que el diámetro crítico del dispositivo, las pérdidas porcentuales de RBC y PLT coincidieron estrechamente con los valores predichos en función de la relación de flujo del dispositivo, es decir, 100/(1 + relación de flujo) (Fig. 3a, línea discontinua).

Rendimiento del dispositivo CIF en el régimen de flujo continuo. Dependencia de la eliminación de células en (a) HCT de muestra (tasa de flujo de 10 ml/min, n = 3), (b) relación de flujo del dispositivo (10 % de HCT, tasa de flujo de 10 ml/min, n = 5) y (c) tasa de flujo (10% HCT, n = 3). En los paneles (a) y (c), la relación de flujo se fijó en 8,70 ± 0,39 y 8,21 ± 0,13 respectivamente, y luego se permitió que cambiara según los parámetros del experimento. En cada panel, una línea discontinua indica el porcentaje esperado de eliminación de células que son más pequeñas que el diámetro crítico del dispositivo calculado en función de la relación de flujo medida en cada experimento. Los valores mostrados son media ± desviación estándar.

Un dispositivo CIF está diseñado para tener una relación de flujo específica, asumiendo la misma presión en las salidas del dispositivo. Para controlar la relación de flujo en tiempo real, creamos una diferencia de presión entre las salidas variando las alturas relativas de los depósitos que recolectan el retenido y el filtrado. A continuación, se calculó la relación de flujo real a la que funcionaba el dispositivo simplemente dividiendo el volumen del filtrado por el volumen del retenido recogido del dispositivo por unidad de tiempo. Esta simple manipulación nos permitió ajustar la relación de flujo dentro de un amplio rango (~ seis veces, Fig. 3b). Los índices de flujo más bajos se asociaron con una mayor eliminación de glóbulos blancos, que se mantuvo constantemente por encima del 80 % para todos los índices de flujo hasta ~ 9 (alcanzando el 84 ± 3 % con el índice de flujo de 8,9 ± 1,5). La eliminación (pérdida) de RBC y PLT siguió la dependencia recíproca esperada de la relación de flujo (Fig. 3b, línea discontinua), disminuyendo rápidamente de 37,5 ± 0,8 % para RBC y 36,1 ± 2,4 % para PLT con una relación de flujo de 1,9 ± 0,1 (34 % de pérdida esperada) a 10,9 ± 1,4 % para glóbulos rojos y 11,4 ± 1,1 % para PLT con una relación de flujo de 8,9 ± 1,5 (10 % de pérdida esperada) y más abajo hasta 8,2 ± 0,9 % para glóbulos rojos y 7,9 ± 1,4 % para PLT con una relación de flujo de 12,6 ± 2,1 (7 % de pérdida esperada) (Fig. 3b). Dada la fuerte dependencia de la pérdida de RBC y PLT en la relación de flujo del dispositivo, la capacidad de ajustar la relación de flujo en tiempo real podría ser útil para hacer coincidir los parámetros clave del procedimiento de leucoféresis (es decir, eliminación de WBC, pérdida de RBC y PLT) con el necesidades únicas de cada paciente.

Además, evaluamos la eficiencia de separación del dispositivo CIF a velocidades de flujo que oscilan entre 10 y 30 ml/min (Fig. 3c). La eliminación de glóbulos blancos disminuyó gradualmente con el aumento de la velocidad de flujo de 88,0 ± 2,5 % a 10 ml/min a 81,0 ± 1,4 % a 30 ml/min. La relación de flujo del dispositivo también disminuyó de 8,21 ± 0,13 a 10 ml/min a 4,00 ± 0,03 a 30 ml/min (Fig. 3c). Esta disminución fue causada por la distorsión de la geometría del canal CIF (abultamiento) debido a la deformación elástica del PDMS a presiones de conducción / caudales más altos, como hemos observado anteriormente para dispositivos similares46. En consecuencia, la pérdida de RBC y PLT aumentó de 12,0 ± 1,1 % para RBC y 13,1 ± 1,5 % para PLT a 10 ml/min a 19,4 ± 0,6 % para RBC y 18,0 ± 2,0 % para PLT a 30 ml/min, siguiendo la tendencia esperado en base a la relación de flujo (Fig. 3c, línea discontinua).

A continuación, probamos el dispositivo CIF en el régimen de recirculación utilizando los parámetros operativos (velocidad de flujo, relación de flujo, HCT de muestra) que maximizaron el rendimiento del dispositivo en los experimentos de flujo continuo. En nuestra configuración de recirculación (Fig. 4a), se usó una bolsa de sangre llena con 179,7 ± 0,8 ml de WB diluida (10% HCT) para emular el TBV de un sujeto. Durante cada ronda de recirculación, se extrajeron de la bolsa 56,5 ± 0,8 ml de la muestra de sangre (a través de un tramo de tubo insertado hasta el fondo de la bolsa a través de uno de sus puertos de muestreo) y luego se pasó a través del dispositivo CIF a una caudal de 10 ml/min. El retenido (5,6 ± 0,5 ml por ronda) se recogió en un tubo cónico, que se elevó por encima del dispositivo CIF para producir la relación de flujo deseada de 8,8 ± 0,3 (Fig. 4a). Para calcular la relación de flujo para un dispositivo que opera en régimen de recirculación, el volumen del filtrado se estimó como la diferencia entre el volumen empujado a través del dispositivo y el volumen del retenido recogido en el depósito de residuos por ronda de recirculación. El filtrado se devolvió a la bolsa a través del otro puerto de muestreo en la parte superior de la bolsa, para colocar efectivamente la 'entrada' y la 'salida' de sangre en los lados opuestos de la bolsa y así promover la mezcla. Además, la bolsa de sangre se mezcló durante y después de cada ronda de recirculación para garantizar una distribución uniforme de las células dentro de la bolsa. Este ciclo de 'retirar-infundir' se repitió 12 veces durante ~ 3,5 horas. Después de completar cada ronda, se tomó una muestra de 0,2 ml de la bolsa (a través de la válvula de muestreo) y el retenido para las mediciones. Se registraron los volúmenes del retenido y de cada muestra extraída para rastrear el cambio en el volumen de la bolsa de sangre después de cada ronda de recirculación.

Eliminación de glóbulos blancos de la sangre durante la recirculación. ( a ) Configuración experimental utilizada para los experimentos de recirculación. La bolsa de sangre se llenó con 179,7 ± 0,8 ml de WB diluida al 10 % de HCT con solución salina normal. El depósito de residuos que recoge el retenido (leucocitos concentrados) se colocó 55 cm por encima del dispositivo; la relación de flujo del dispositivo resultante fue de 8,8 ± 0,3. En cada ronda de recirculación, se extrajeron 56,5 ± 0,8 ml de la muestra de la bolsa y luego se infundieron a través del dispositivo CIF a una velocidad de flujo de 10 ml/min, mientras se producían 5,6 ± 0,5 ml de retenido (desecho). Se usó una jeringa de 1 mL para muestrear la sangre proveniente de la bolsa. Las flechas indican la dirección del flujo de sangre en el circuito. (b) Cambios en las concentraciones de células después de cada ronda de separación de células basada en CIF en el régimen de recirculación. Los valores que se muestran son la media ± desviación estándar (n = 9, usando sangre de 6 sujetos únicos). Las líneas continuas son ajustes lineales para volumen (y = − 0,0608x + 1,7975, R2 = 0,9997), glóbulos rojos (y = − 0,0044x + 1,1037, R2 = 0,8218) y PLT (y = − 0,0059x + 0,6072, R2 = 0,8485) , y un ajuste de modelo para WBC (con una eliminación de WBC del 81 % que minimiza el error cuadrático medio).

La concentración de glóbulos blancos en la bolsa de sangre disminuyó exponencialmente a lo largo del experimento de recirculación (Fig. 4b). Después de 3 rondas de recirculación (~ 170 ml de volumen procesado), la concentración de WBC disminuyó en un 55 %, de 1,59 ± 0,41 × 103/µL en la muestra inicial a 0,72 ± 0,26 × 103/µL. En la ronda 6 (~ 340 ml de volumen procesado), la concentración de WBC disminuyó aún más hasta 0,28 ± 0,15 × 103/µL (disminución del 82 % con respecto al nivel inicial). Al final del experimento de recirculación (alrededor de 12, ~ 680 ml de volumen procesado), los glóbulos blancos en la bolsa prácticamente se agotaron (~ 98% de disminución desde el nivel inicial). La concentración de RBC y PLT disminuyó linealmente durante toda la duración del experimento de recirculación (Fig. 4b): ~ 4,5 % para RBC (de 1,09 ± 0,03 × 106/µL a 1,04 ± 0,05 × 106/µL; y = − 0,0044 x + 1,1037, R2 = 0,8218), y ~ 14,5 % para las PLT (de 0,62 ± 0,07 × 105/µL a 0,53 ± 0,06 × 105/µL; y = − 0,0059x + 0,6072, R2 = 0,8485). Las células que son más pequeñas que el diámetro crítico del dispositivo CIF se distribuyen de acuerdo con la relación de flujo y, por lo tanto, su concentración debe ser la misma tanto en el filtrado como en el retenido. Por lo tanto, investigamos el efecto de la recirculación de sangre a través del dispositivo CIF sobre las propiedades de las células sanguíneas.

Usamos citometría de flujo de imágenes (FC) para medir la activación de WBC (CD11b) y PLT (CD62P), y la formación de agregados de PLT-WBC para las muestras recolectadas de la bolsa antes (ronda 0), durante (ronda 6) e inmediatamente después ( ronda 12) los experimentos de recirculación (Fig. 5). Se midió la activación de WBC separados (salida de retenido) durante (ronda 6) y después (ronda 12) del experimento. Además, en cuatro de los cinco experimentos de recirculación, una muestra de la sangre de los sujetos se dejó a un lado en la mesa de trabajo (BT) durante la duración del experimento para controlar la activación de WBC y PLT de simplemente almacenarse a temperatura ambiente durante un período prolongado. período. Todas las muestras se analizaron en reposo (tal como se recogieron) y después de la incubación con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA; para WBC, Fig. 5a, b) o agonista del receptor de trombina péptido-6 (TRAP; para PLT y PLT-WBC). agregados, Fig. 5c, d) para evaluar cómo la recirculación de CIF afectó la capacidad de los WBC y las PLT para activarse en respuesta a estímulos relevantes.

Efecto del procesamiento CIF en régimen de recirculación sobre el estado de activación de WBC y PLT. (a) Activación de glóbulos blancos (CD11b) que quedan en la sangre recirculante. (b) Activación de glóbulos blancos (CD11b) eliminados con el retenido (residuos). c) Activación de PLT recirculantes (CD62P). (c) Formación de agregados de PLT-WBC en la sangre recirculante. Las mediciones se realizaron mediante citometría de flujo para muestras recolectadas antes (ronda 0), durante (ronda 6) y después (ronda 12) del experimento de recirculación, tanto en reposo como después de activación adicional con PMA (paneles a y b) o TRAP (paneles cd). BT (símbolos rojos) representan muestras de sangre reservadas durante la duración de cada experimento de recirculación para evaluar el efecto del tiempo solo en la activación celular. La significación estadística se denota con * para p < 0,05. Cada símbolo representa un experimento de recirculación diferente (n = 5, usando sangre de 4 sujetos únicos).

Los glóbulos blancos en la sangre recirculante se activan cada vez más, pero al final del experimento de recirculación (después de la ronda 12), no estaban más activados que el control BT (Fig. 5a). Los glóbulos blancos extraídos con el retenido estaban tan activados como los glóbulos blancos restantes en la sangre recirculante, y no hubo una diferencia significativa en la activación entre las células extraídas en las rondas 6 y 12 (Fig. 5b). Tanto los glóbulos blancos recirculantes como los eliminados pudieron activarse significativamente más después de la incubación con PMA (control positivo), independientemente de cuándo se tomaron muestras durante el experimento de recirculación, lo que sugiere que las células no se volvieron refractarias después del procesamiento (Fig. 5a, b).

A pesar del efecto potencial del cizallamiento sobre las PLT, la activación de las PLT en la sangre recirculante no aumentó significativamente durante toda la duración del experimento. Después de la ronda 12 de recirculación a través del dispositivo CIF, el nivel de activación de PLT fue similar al del control BT (Fig. 5c). La baja activación podría deberse a la refractariedad de las PLT, lo cual no fue el caso porque las PLT recirculantes pudieron activarse significativamente tras la exposición a TRAP (control positivo) (Fig. 5c). Dada la alta sensibilidad de las PLT al cizallamiento y nuestros hallazgos publicados previamente con dispositivos CIF similares43,44,45, esperábamos observar al menos algún aumento en la activación de las PLT recirculantes. Una posible explicación es que la mayoría de las PLT que se activaron se unieron rápidamente a los WBC disponibles para formar agregados de PLT-WBC. De hecho, la cantidad de agregados de PLT-WBC aumentó de manera constante y significativa con el tiempo durante cada experimento de recirculación (Fig. 5d). Las PLT que participan en los agregados de PLT-WBC se excluyen cuando se miden la activación y el recuento de PLT, lo que puede explicar que la activación de las PLT recirculantes permanezca relativamente baja (Fig. 5c) y su concentración disminuya gradualmente con el tiempo (Fig. 4b). En general, la cantidad de agregados de PLT-WBC en la sangre recirculante después de 12 rondas de recirculación fue la misma que en el control BT (Fig. 5d), lo que sugiere que el aumento probablemente se debió a la duración del procesamiento, y la contribución del dispositivo CIF fue relativamente menor. Además, se deduce que una posible solución para minimizar la activación celular y la formación de agregados de PLT-WBC sería reducir la duración del procesamiento aumentando el rendimiento volumétrico (p. ej., mediante multiplexación adicional) o la eficiencia de separación (p. ej., mediante mejoras de diseño adicionales) de el dispositivo.

Finalmente, probamos si la recirculación a través del dispositivo CIF dañó los glóbulos rojos al medir los niveles de hemoglobina libre (Hb) y potasio antes (ronda 0), durante (ronda 6) e inmediatamente después (ronda 12) de cada experimento. Previamente, empleamos los mismos ensayos para identificar con sensibilidad el daño subletal causado por la centrifugación de los glóbulos rojos almacenados durante el lavado47,48. A lo largo del procedimiento de recirculación CIF, no observamos cambios significativos en los niveles de Hb libre y los niveles de potasio permanecieron por debajo del nivel detectable (< 0,2 mM) en todas las muestras (Tabla S1). En ausencia de cualquier indicación de hemólisis, la explicación más probable para la disminución observada de la concentración de glóbulos rojos en la sangre recirculante (Fig. 4b) es que se eliminó una cantidad excesiva de glóbulos rojos con el retenido. De hecho, la concentración de glóbulos rojos en el retenido (residuos) fue consistentemente más alta que en la sangre recirculante (Fig. 4b), en promedio alrededor de 0,1 × 106/µL (Tabla S2). Como se discutió en nuestro estudio anterior en el que observamos una acumulación similar de glóbulos rojos en el retenido al procesar muestras de leucoféresis46, los glóbulos rojos son discos bicóncavos altamente deformables (~ 8 µm de diámetro y solo ~ 2 µm de espesor) y, por lo tanto, su diámetro efectivo podría variar ampliamente. dependiendo de las condiciones específicas cerca de cada brecha de filtración. La mayoría de los glóbulos rojos tienen un diámetro efectivo lo suficientemente pequeño para seguir el filtrado, pero algunos no lo tienen y, por lo tanto, tienden a permanecer en el canal central creando la acumulación característica46.

Las máquinas de aféresis convencionales utilizan la centrifugación para separar los WBC de los RBC y las PLT, lo que limita el grado en que se puede reducir el ECV del circuito de leucaféresis para satisfacer las necesidades de los pacientes pediátricos. El volumen vacío del dispositivo CIF (0,4 ml) descrito en este estudio fue al menos 100 veces menor que el de una máquina de aféresis típica basada en centrifugación (150–250 ml)49. Esta drástica reducción del ECV representa la principal ventaja de utilizar la separación celular por microfluidos para, en última instancia, permitir un procedimiento de leucoaféresis seguro y eficaz en niños pequeños. Este estudio se basa en nuestros diseños CIF anteriores46, para abordar una aplicación completamente nueva y mucho más desafiante que lo que hemos explorado anteriormente. Por primera vez, se demuestra que un dispositivo de microfluidos CIF es capaz de separar glóbulos blancos de sangre total diluida con una eficiencia > 80 % mientras opera en el régimen de recirculación durante > 3 horas sin una disminución notable en el rendimiento de la separación y con un efecto mínimo en las propiedades celulares. Además, el dispositivo actual funcionó de manera óptima con un HCT que era 2 veces mayor y con una pérdida de RBC y PLT que era 2-3 veces menor que en cualquiera de nuestros informes anteriores46.

Los pacientes pediátricos que se someten a leucaféresis por leucodepleción o colección celular suelen estar anémicos, con un HCT promedio de 20 a 30%49,50. Con un 20 % de HCT, el dispositivo CIF tuvo una eficiencia de eliminación de glóbulos blancos de ~ 60 %, lo que puede ser un nivel de rendimiento aceptable en algunos pacientes. Para operar el prototipo de dispositivo CIF actual con su máxima eficiencia de separación (eliminación de glóbulos blancos > 80 %), la sangre tendría que diluirse al 10 % de HCT antes de ingresar al dispositivo y luego concentrarse de nuevo en su HCT nativo antes de regresar al paciente. Dicha hemoconcentración se realiza de forma rutinaria durante el bypass cardiopulmonar pediátrico y la oxigenación por membrana extracorpórea para eliminar el exceso de líquidos, utilizando dispositivos con excelente biocompatibilidad y volumen vacío mínimo (p. ej., 8 ml, Hemocor HPH Junior, Minntech Corp., Minneapolis, MN) a velocidades de flujo compatibles con leucoféresis (hasta 100 ml/min)51. La disminución en el rendimiento de separación del dispositivo en HCT más altos podría explicarse por el número creciente de interacciones estocásticas célula-célula y la desviación de la viscosidad aparente de la sangre en los canales del modelo que usamos al diseñar el dispositivo, los cuales se vuelven más pronunciado con el aumento de HCT46,52,53. Se necesitará investigación adicional para abordar estos factores para aumentar aún más la eficiencia de separación CIF en HCT más altos.

La velocidad de flujo a la que operó el dispositivo CIF con un rendimiento máximo de separación en nuestro estudio (10 ml/min) es similar a los procedimientos de leucoaféresis clínica, que normalmente se realizan a 10–50 ml/min1,17,54. La disminución observada en la eficiencia de separación a velocidades de flujo más altas probablemente se debió a la deformación (abultamiento) de los canales del dispositivo a presiones de conducción más altas, como observamos anteriormente para dispositivos similares46. Este efecto podría minimizarse fabricando en última instancia dispositivos CIF con termoplásticos duros en lugar del elastómero PDMS que usamos en este estudio39,40,55.

El HCT (10 %) y la velocidad de flujo (10 ml/min) a los que operó el dispositivo CIF con su rendimiento óptimo fueron significativamente más altos que los informados anteriormente para otros dispositivos de microfluidos diseñados para separar los glóbulos blancos de la sangre total mínimamente diluida39,40,42,56 ,57,58,59,61. Es importante destacar que este estudio fue el primero en demostrar un dispositivo de microfluidos capaz de separar células de la sangre de manera altamente eficiente mientras operaba en el régimen de recirculación, a diferencia del régimen de flujo continuo empleado por todos los demás dispositivos de separación de células por microfluidos32.

La recirculación en este estudio se logró utilizando una bomba de jeringa programada para pasar por múltiples ciclos de "retirada-infusión" durante toda la duración del procedimiento. Este enfoque de la recirculación se parece mucho al funcionamiento de una máquina de aféresis en el modo discontinuo que suele emplearse para VCE más grandes o procedimientos de mayor duración1,49, o a la exanguinotransfusión manual que a veces se realiza en niños pequeños cuando la leucoaféresis basada en centrifugación se considera demasiado arriesgada debido a el estado hemodinámico de un paciente, una TBV relativamente pequeña en comparación con la ECV del circuito y/o la capacidad para colocar un catéter de tamaño adecuado28,62. Sorprendentemente, el dispositivo CIF pudo procesar sangre sin ningún signo de obstrucción mientras mantenía su eficiencia de separación durante > 3 h, que es la duración típica de un procedimiento de leucoaféresis convencional1,17,54,62. Este hallazgo es particularmente significativo porque cualquier dispositivo destinado a la leucoféresis debe ser capaz de procesar sangre recirculante durante un período de tiempo prolongado.

En el contexto de la leucorreducción, la leucaféresis convencional basada en centrifugación normalmente reduciría la concentración de glóbulos blancos en aproximadamente un tercio cuando se procesan 1 o 2 TBV50 y aproximadamente en la mitad cuando se procesan 2 o 3 TBV63. El dispositivo CIF pudo reducir la concentración de glóbulos blancos en la sangre recirculante aproximadamente el doble de rápido: a la mitad después de procesar solo un TBV y a cuatro quintos después de procesar dos TBV. Desde la perspectiva clínica, es importante minimizar la pérdida de glóbulos rojos y plaquetas durante el procedimiento de leucaféresis para reducir los riesgos asociados con la transfusión de hemoderivados alogénicos. La pérdida de PLT durante la operación del dispositivo CIF fue de ~ 2 a 3 veces menor que lo que sería típico para un procedimiento basado en centrifugación (para el cual las PLT se eliminan a la misma velocidad que los WBC porque ambos tipos de células se localizan en la "capa leucocítica"). 'capa)50,63. Se necesitará investigación adicional para aumentar la relación de flujo del dispositivo CIF para reducir aún más las pérdidas de RBC y PLT.

La exposición a altas fuerzas de cizallamiento durante la centrifugación puede causar daños mecánicos en las membranas celulares, inducir una activación celular excesiva y desencadenar respuestas hemostáticas, lo que contribuye a la serie de resultados adversos asociados con la leucoaféresis en recién nacidos y lactantes21,24,28,64. En nuestros experimentos, los WBC y las PLT en la sangre recirculante no se activaron más que las células en el control BT (muestra dejada en el banco durante el procedimiento), lo que sugiere una activación adicional mínima contribuida por el dispositivo CIF. Además, tanto los WBC como las PLT pudieron activarse después de la exposición a un estimulante apropiado, lo que sugiere que las células no eran refractarias después del procesamiento CIF. Finalmente, tampoco encontramos evidencia de daño a los glóbulos rojos. En conjunto, nuestros datos sugieren fuertemente que el dispositivo CIF que opera en el régimen de recirculación de circuito cerrado no activó ni dañó significativamente las células sanguíneas.

La centrifugación se utiliza para realizar la leucaféresis porque ha sido la única tecnología capaz de separar los glóbulos blancos con la eficiencia requerida y el rendimiento volumétrico de la sangre recirculante. Este estudio demuestra la viabilidad de utilizar la tecnología de separación de células microfluídicas de alto rendimiento para, en última instancia, permitir la leucoféresis de bajo ECV sin centrifugación. Tal capacidad sería particularmente útil en niños pequeños, un grupo vulnerable de pacientes que actualmente están desatendidos.

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones establecidas por la Universidad de Houston y el Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU. para la protección de los sujetos humanos. Todos los protocolos experimentales que involucran muestras de sangre humana fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Houston (Comité para la Protección de Sujetos Humanos 1, protocolo n.º 16272-01). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos y/o sus tutores legales. Las unidades de sangre completa (WB) se compraron en el Centro Regional de Sangre de la Costa del Golfo (Houston, TX). Se obtuvieron muestras de WB fresco mediante punción venosa de voluntarios sanos (anticoagulante: dextrosa ácida cítrica, solución A; Vacutainer, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Las muestras se usaron inmediatamente o se almacenaron en un refrigerador de banco de sangre (4 °C, iB111, Helmer Scientific, Noblesville, IN) hasta su uso, y se diluyeron con solución salina isotónica (0,9 % p/v de NaCl, RICCA Chemical Company, Arlington, TX) para lograr el hematocrito deseado (HCT).

El diseño y la fabricación de dispositivos basados en tecnología de filtración incremental controlada (CIF) se han descrito previamente en detalle43,44,45,46. En un diseño CIF típico, el ancho de todos los espacios de filtración se fija en ~ 20 µm porque los dispositivos microfluídicos con un 'tamaño de característica mínimo' inferior a 20 µm son muy difíciles de producir en masa utilizando los métodos de fabricación actualmente disponibles43. De manera similar, la capacidad de fabricación de dispositivos microfluídicos con una relación de aspecto (profundidad: ancho) superior a ~ 7: 1 es muy limitada. Por lo tanto, los dispositivos CIF están diseñados para tener profundidades de canal de ~ 140 µm para tener la resistencia a los fluidos lo más baja posible (y, por lo tanto, mayor tasa de flujo/rendimiento a una presión de conducción dada) mientras se mantiene la capacidad de fabricación fundamental del diseño. Dado que el ancho de los espacios es fijo, la fracción de flujo que pasa de los canales centrales a los laterales en cada espacio está controlada por el cambio en los anchos de los canales, como se describió anteriormente en detalle44. Si esta fracción de flujo de filtración es cero, no fluye ningún fluido a través de los espacios y, por lo tanto, el fluido no transporta células a los canales laterales. A medida que aumenta la fracción de flujo de filtración, aumenta la cantidad de fluido que fluye a través de cada espacio y, por lo tanto, también aumenta el tamaño de las celdas que son lo suficientemente pequeñas para ser arrastradas por el flujo hacia los canales laterales. Las células que son demasiado grandes para ser arrastradas por el fluido que fluye a través de los espacios permanecerán en el canal central. Por lo tanto, la magnitud del flujo de fluido a través de los espacios determina el límite del tamaño de la separación (no el ancho del espacio que permanece constante). Este desacoplamiento del límite de tamaño del ancho del espacio permite que los dispositivos CIF con espacios de 20 µm separen con éxito partículas/células que son más pequeñas que los espacios, como se demostró anteriormente43,44,45,46.

El diseño del dispositivo CIF, generado con código personalizado en MATLAB (The MathWorks Inc, Natick, MA), se transfirió a una capa de fotorresistencia de ~ 140 µm de espesor (SU-8 3050; Kayaku Advanced Materials Inc, Westborough, MA) en un Oblea de silicio de 4″ (University Wafer, South Boston, MA) utilizando litografía blanda. La oblea maestra se replicó en poli(dimetilsiloxano) (PDMS; Sylgard 184, Dow Corning Corp, Midland, MI), y la réplica de PDMS (capa del dispositivo) se selló contra una placa de Petri recubierta de PDMS (sustrato plano) usando plasma de oxígeno ( PDC-001, Harrick Plasma, Ithaca, Nueva York). Los puertos de entrada y salida en la capa del dispositivo se crearon utilizando punzones de biopsia (Acuderm Inc, Fort Lauderdale, FL) del tamaño adecuado para que coincidan con las conexiones de los tubos (diámetros internos de 1,02 y 0,58 mm; Scientific Commodities, Havasu City, AZ). Una capa adicional de PDMS que contiene un sistema de grandes canales para recolectar las salidas de filtrado y retenido de los elementos CIF individuales de un dispositivo multiplexado se unió en la parte superior de la capa del dispositivo. Después de la unión, cada dispositivo CIF ensamblado se trató con una solución acuosa al 1 % (p/v) de mPEG-silano (MW 5000, Laysan Bio Inc, Arab, AL) durante 25 min a 70 °C. Finalmente, el dispositivo se enjuagó con tampón GASP (Na2HPO4 9 mM, NaH2PO4 1,3 mM, NaCl 140 mM, glucosa 5,5 mM, albúmina sérica bovina al 1 % p/v, 290 mmol/kg, pH 7,4) y se almacenó a 4 °C hasta usar.

La configuración de recirculación consistió en una bolsa de sangre (500 ml; Fenwal 4R1590, GenesisBPS, Ramsey, NJ) que se conectó al dispositivo CIF multiplexado y a otros componentes del circuito mediante tubos de plástico (Scientific Commodities) conectados a través de conectores Luer-lock del tamaño adecuado. (Qosina, Ronkonkoma, Nueva York). El tubo que transportaba la muestra de sangre desde el fondo de la bolsa de sangre hasta el dispositivo CIF se conectó a una bomba de jeringa (Genie Touch, Kent Scientific, Torrington, CT) y la entrada del dispositivo CIF a través de dos llaves de paso de 3 vías (Qosina) . Se usó una llave de paso para tomar muestras de la sangre proveniente de la bolsa y la otra llave de paso se usó para conectar la bomba de jeringa con la salida de la bolsa (para extraer sangre de la bolsa) o la entrada del dispositivo (para infundir sangre a través de la bolsa). el dispositivo). El modo de funcionamiento de la bomba (infusión/retirada) y la posición de la llave de paso se establecieron manualmente durante el experimento. La bolsa de sangre se mezcló a mano durante y después de cada ronda de recirculación.

Se midieron hemogramas completos con un diferencial de 5 partes usando un analizador de hematología (XS-1000i, Sysmex America, Inc., Mundelein, IL). Se utilizaron recuentos de WBC, RBC y PLT para calcular el porcentaje de eliminación para cada tipo de célula de la siguiente manera: \(\% eliminación={C}_{r}/\left({C}_{r}+{C}_{ f}\times FR\right)\times 100\), donde \({C}_{r}\) es el recuento de células en el retenido (salida del canal central de todos los elementos CIF), \({C}_{ f}\) es el recuento de células en el filtrado (salida del canal lateral de todos los elementos CIF), y \(FR\) es la relación de flujo del dispositivo (definida como la relación entre el volumen acumulativo de la salida de filtrado y el de la salida de retenido del dispositivo) 46. Todas las relaciones de flujo se calcularon en base a los volúmenes medidos.

Se usó citometría de flujo de imágenes (FC, Amnis ImagestreamX Mk II, Luminex Corporation, Austin, TX) para medir los marcadores de activación de antígenos de superficie de PLT y WBC, y la prevalencia de agregados de PLT-WBC, usando los siguientes cócteles de anticuerpos (todos de BD Biosciences, San José, CA). Activación de PLT: CD41a/APC (20 µL; BD 559,777), CD62P/PE (20 µL; BD 555,524), solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio (DPBS-/-; 10 µL). El péptido agonista del receptor de trombina 6 (TRAP; 70 µM; Sigma) se usó como control positivo para la activación de PLT. Activación de WBC: CD45/APC (5 µL; BD 561,864), CD62L/FITC (20 µL; BD 555,543), CD11b/PE (20 µL; BD 555,388) y DPBS-/- (25 µL). Se usó acetato de miristato de forbol (PMA; 0,5 µg/mL; Sigma) como control positivo para la activación de WBC. Agregados de PLT-WBC (PLA): CD45/APC (5 µL), CD41a/FITC (20 µL; BD 555,466) y DPBS-/- (45 µL). Se usó TRAP (70 µM) como control positivo para la formación de PLA. Para realizar las mediciones de FC, se agregaron 30 µL de la muestra de sangre a cada cóctel de anticuerpos, se mezcló suavemente y se dejó incubar en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente (RT). Después del etiquetado de anticuerpos, los glóbulos rojos se lisaron usando una solución de lisis 1X BD FACS durante 15 min a temperatura ambiente. Después de la lisis, las muestras se centrifugaron a 900 × g durante 5 min para eliminar el sobrenadante, las células sedimentadas se resuspendieron en 100 µL de paraformaldehído al 1 % y luego se almacenaron a 4 ºC hasta que se realizaron las mediciones de FC (dentro de las 24 h).

El nivel de hemoglobina libre (Hb) en el sobrenadante se midió usando el método de cianmetahemoglobina modificada siguiendo las instrucciones del fabricante (reactivo de Drabkin; D5941, Sigma). Brevemente, se centrifugó una muestra de sangre a 1000 × g durante 5 min para sedimentar los glóbulos rojos, luego se agregaron 40 µl del sobrenadante a 160 µl de reactivo de Drabkin y se incubó durante 20 min. La absorbancia se midió a 540 nm utilizando un lector de placas (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). La concentración de Hb se calculó usando una curva de calibración construida con un patrón de Hb humano (Pointe Scientific Inc, Canton MI). El nivel de potasio (K+) se midió usando un analizador de sangre portátil (i-STAT, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) usando cartuchos CHEM8+, como se describió previamente47.

Todos los valores se expresaron como media ± desviación estándar. La significación estadística (definida como p < 0,05) de las diferencias observadas se determinó utilizando la prueba t de dos caras pareadas para datos de recuento de células, ANOVA de una vía para mediciones de Hb y ANOVA de medidas repetidas de 2 vías o una prueba de efectos mixtos. modelo (máxima verosimilitud restringida) emparejado tanto por tiempo como por estado de activación con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak para mediciones de FC.

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La investigación informada en esta publicación fue financiada en parte por la Beca Inicial de Investigación del Área de Alta Prioridad de la Universidad de Houston (I0503554, PI: SSS) y por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de la Salud con el número de concesión R01HL151858 (PI :SSS). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud, el Departamento de Asuntos de Veteranos de EE. UU. o el Gobierno de los Estados Unidos.

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Houston, 3605 Cullen Blvd, Houston, TX, 77204-5060, EE. UU.

Dalia L. Lezzar, Ravin Huerta, Anton Mukhamedshin, Madeleine Lu y Sergey S. Shevkoplyas

División de Medicina de Cuidados Críticos Pediátricos, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, EE. UU.

Fong W. Lam

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DLL, FWL y SSS diseñaron el estudio y analizaron los datos. FWL y SSS obtuvieron financiación y supervisaron el proyecto. DLL y ML fabricaron los dispositivos de microfluidos. DLL, FWL, RH y ML realizaron los experimentos. AM ayudó con el análisis de datos y la interpretación. DLL, FWL y SSS escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron críticamente y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Sergey S. Shevkoplyas.

SSS es inventor de la patente estadounidense n.º 9.789.235 "Separación y concentración de partículas" que describe la tecnología de filtración incremental controlada y copropietario de Halcyon Biomedical Incorporated, una empresa que se beneficiaría de su comercialización. Todos los demás autores declaran no tener conflicto de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Lezzar, DL, Lam, FW, Huerta, R. et al. Un dispositivo de microfluidos de alto rendimiento basado en la filtración incremental controlada para permitir la leucoféresis de bajo volumen extracorpóreo sin centrifugación. Informe científico 12, 13798 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16748-5

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Recibido: 02 Marzo 2022

Aceptado: 14 julio 2022

Publicado: 13 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16748-5

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