Emulsiones dobles como subidón - Grupo Co., Ltd de los laboratorios de minería de Foshan

ISME Communications volumen 3, Número de artículo: 47 (2023) Citar este artículo

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Nuestra comprensión de la fisiología microbiana in situ se basa principalmente en la caracterización fisiológica de microbios de rápido crecimiento y fácilmente aislables. Los enriquecimientos microbianos para obtener aislamientos novedosos con tasas de crecimiento más lentas o fisiologías adaptadas a entornos bajos en nutrientes están plagados de sesgos intrínsecos para las especies de crecimiento más rápido cuando se utilizan protocolos de aislamiento de laboratorio estándar. Se necesitan nuevas herramientas de cultivo para minimizar estos sesgos y enriquecer taxones menos estudiados. En este estudio, desarrollamos una plataforma de enriquecimiento bacteriano de alto rendimiento basada en la encapsulación de células individuales y el crecimiento dentro de emulsiones dobles (GrowMiDE). Demostramos que GrowMiDE puede cultivar muchos microorganismos diferentes y enriquecer taxones subrepresentados que nunca se observan en los enriquecimientos por lotes tradicionales. Por ejemplo, evitar el dominio del enriquecimiento por microbios de crecimiento rápido debido a la privatización de nutrientes dentro de las gotitas de emulsión doble permitió el cultivo de Negativicutes y Methanobacteria de crecimiento más lento a partir de muestras de heces en cultivos de enriquecimiento de medios ricos. En experimentos de competencia entre cepas especializadas en tasa de crecimiento y rendimiento de crecimiento, los enriquecimientos de GrowMiDE impidieron la competencia por las reservas de nutrientes compartidas y enriquecieron las cepas de crecimiento más lento pero más eficientes. Finalmente, demostramos la compatibilidad de GrowMiDE con la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) comercial para obtener aislamientos a partir de enriquecimientos de GrowMiDE. Juntos, GrowMiDE + DE-FACS es una nueva y prometedora plataforma de enriquecimiento de alto rendimiento que se puede aplicar fácilmente a diversos enriquecimientos microbianos o pantallas.

Nuestra comprensión de la fisiología microbiana se basa en gran medida en estudios que utilizan microbios aislados en cultivos puros. Las técnicas para aislar microbios novedosos durante los últimos 140 años implican recrear un entorno favorable y un flujo de nutrientes en el laboratorio que imite las condiciones naturales y luego intentar recuperar las especies novedosas cultivadas. Como resultado, los métodos actuales están intrínsecamente sesgados hacia los microbios de crecimiento rápido que pueden superar a otras especies por los nutrientes compartidos, incluso especies con diferencias menores en la tasa de crecimiento máxima (µMax) (Fig. S1–S3) [1, 2]. Las especies de crecimiento más lento que faltan podrían tener estrategias fisiológicas desconocidas para adaptarse a su entorno natural y que probablemente desempeñen un papel fundamental en la resiliencia de la comunidad [3]. Por ejemplo, la eficiencia de crecimiento (rendimiento de crecimiento) sobre las tasas de crecimiento ha sido sugerida como una estrategia de supervivencia en ambientes con bajo flujo de nutrientes o estructurados espacialmente, incluyendo biopelículas [1, 2, 4] y el ambiente del subsuelo marino (~30% de la biomasa de la Tierra) [5,6,7,8]. Un desafío adicional no trivial es crear un entorno químico adecuado que apoye el crecimiento de diferentes estilos de vida microbianos (p. ej., oligotrofos o copiotrofos). Por lo tanto, existe una necesidad crítica de desarrollar nuevas herramientas de cultivo que minimicen el sesgo de tasas de crecimiento microbiano rápidas.

Los métodos tradicionales que limitan la competencia por recursos finitos (es decir, mediante la privatización de nutrientes) normalmente se basan en la separación espacial e incluyen la dilución hasta la extinción o la siembra de unidades formadoras de colonias [9, 10]. Sin embargo, estas técnicas dependen de la abundancia de células, son de bajo rendimiento y no conducen a la recuperación de microbios que crecen mal en las interfaces aire-líquido, especialmente anaerobios [11, 12]. Los enfoques de microfluidos de gotas han surgido como una poderosa técnica de alto rendimiento para cultivar nuevos microorganismos en biorreactores aislados, cada uno con distribuciones precisas de los reactivos necesarios para el crecimiento [10, 13,14,15,16], lo que facilita la detección de resistencias a los antibióticos [13, 17, 18], y mediciones de actividad celular [19,20,21]. La mayoría de los enfoques microbiológicos de gotas utilizan gotas de una sola emulsión, en las que las gotas acuosas que contienen células y medio se suspenden dentro de una fase oleosa. Muchos estudios han demostrado la utilidad de microfluidos de gotas de emulsión única para estudiar la diversidad microbiana [21,22,23,24], obtener genomas de alta calidad [25] y pantallas funcionales [10, 13, 16, 18]. Las técnicas de enriquecimiento de una sola emulsión también han demostrado la selección de cepas que tienen rendimientos de crecimiento elevados o tasas de crecimiento más lentas, lo que sirve como prueba de concepto para el impacto de la privatización de nutrientes en los resultados del enriquecimiento [26]. Sin embargo, las gotas de una sola emulsión requieren un equipo personalizado para analizarlas aguas abajo y solo se han clasificado en demostraciones de prueba de concepto con velocidades de clasificación lentas y canales de fluorescencia limitados [27, 28], lo que dificulta su aplicación en nuevos sistemas.

Las gotitas de emulsión doble (DE) son una plataforma microfluídica innovadora con el potencial de simplificar en gran medida el crecimiento y los aislamientos microbianos [29,30,31,32]. Los DE consisten en un compartimento acuoso interno rodeado por una capa de aceite suspendida dentro de una capa acuosa externa (Fig. 1B). La suspensión acuosa externa hace que las DE sean directamente compatibles con los equipos de citometría de flujo comunes, lo que les permite clasificarse mediante clasificación controlada por fluorescencia (FACS) similar a las células [33]. El trabajo reciente que optimiza el diseño del dispositivo, los tensioactivos y los parámetros de clasificación ha mejorado la capacidad de clasificar los DE con un alto rendimiento (12–14 kHz) y precisión de gota única (> 99 % de pureza, 70 % de recuperación de gota única) en instrumentos FACS tradicionales [33, 34]. Las aplicaciones actuales de la tecnología DE incluyen la encapsulación de células [21, 29], la administración de fármacos [31] y las pruebas de función de proteínas [21]. Sin embargo, los DE aún no se han utilizado como plataforma de enriquecimiento para microorganismos.

Una representación esquemática de la plataforma GrowMiDE. Cuatro bombas de jeringa impulsan soluciones acuosas y de aceite a un dispositivo microfluídico personalizado para encapsular microbios individuales dentro de emulsiones dobles (DE) de 30 o 45 µm de diámetro; La generación de DE es monitoreada en tiempo real por una cámara de alta velocidad conectada a un estereoscopio Amscope. B Imagen esquemática y representativa de campo claro de gotas de DE (barra de escala = 30 µm). C Imágenes combinadas de campo claro y fluorescentes de células únicas de E. coli-GFP cargadas en DE (izquierda) y después del crecimiento en M9 + glucosa durante 24 h (derecha). D Imágenes de microscopía de campo claro que indican el crecimiento de diversos anaerobios dentro de los DE, incluido el reductor de sulfato Desulfovibrio ferrophilus IS5 en lactato 60 mM y NaSO4 30 mM, el acetógeno Thermoanaerobacter kivui en glucosa 50 mM a 65 °C, fermentador productor de ácido láctico Lactococcus lactis NZ9000 en glucosa 50 mM y fermentador ácido mixto E. coli MG1655 en glucosa 50 mM.

Diseñamos una plataforma DE de alto rendimiento (GrowMiDE) que (i) es compatible con diversas fisiologías microbianas, (ii) facilita enriquecimientos y aislamientos posteriores para caracterizaciones fenotípicas posteriores, y (iii) demuestra la recuperación de especies microbianas que normalmente se pierden debido a competencia en los enriquecimientos de cultivo por lotes. La plataforma GrowMiDE minimizó el sesgo de tasas de crecimiento rápido a través de la privatización de nutrientes en gotas individuales, lo que facilitó el enriquecimiento de especies de crecimiento más lento. Usando GrowMiDE, demostramos el enriquecimiento de distintas composiciones comunitarias en comparación con los cultivos por lotes tradicionales del microbioma intestinal humano, incluido un aumento de 22 veces en una nueva especie de Negativicutes de la lista de microbiomas "más buscados" [35]. También determinamos que GrowMiDE se puede aplicar para enriquecer taxones nuevos debido a la priorización de rasgos distintos de las tasas de crecimiento rápido, específicamente rendimientos de crecimiento más altos. Finalmente, demostramos la combinación de GrowMiDE y DE-FACS como una herramienta de aislamiento para microbiólogos. Esta plataforma se puede adaptar fácilmente a diversos sistemas biológicos y nuestros resultados demuestran la viabilidad del cultivo de DE de alto rendimiento para obtener representantes cultivados de fisiologías pasadas por alto.

E. coli MG1655 y E. coli-GFP se cultivaron de forma rutinaria en agar LB o medio M9 suplementado con glucosa 25 mM a 37 °C con agitación. Lactococcus lactis spp cremoris WT (NZ9000) y el mutante derivado ∆ldhA (NZ9010) [26] se cultivaron en 10 ml de medio químicamente definido (CDM) [36] suplementado con 1,5 % de casaminoácidos (p/v), 26 mg/ L L-triptófano y glucosa 50 mM a 30 °C. Los cultivos iniciadores de NZ9000 o NZ9010 se inocularon a partir de una sola colonia de placas de caldo Difco M17 + glucosa 25 mM (GM17) o GM17 + 5 ug/ml de eritromicina, respectivamente. Pseudomonas putida se cultivaron rutinariamente en agar LB o placas de cetrimida. Todas las curvas de crecimiento se iniciaron con un inóculo al 1% de un cultivo iniciador en fase estacionaria. Para el cultivo de anaerobios estrictos en DE, se utilizaron como inóculos cultivos estacionarios de 20 ml cultivados en viales de suero anaerobio de 60 ml. Desulfovibrio ferrophilus IS5 (DSM n.º 15579) se cultivó a 30 °C en un medio de agua de mar artificial modificado [37] suplementado con lactato 60 mM y sulfato 30 mM. Thermoanaerobacter kivui TKV002 se cultivó a 65 °C en un medio que contenía MES 25 mM (ácido libre), MES 75 mM (sal de sodio), NaCl 13,7 mM, MgSO4 0,8 mM, NH4Cl 18,7 mM, KCl 1,3 mM, CaCl2 0,1 mM, CaCl2 0,7 mM KH2PO4, uracilo 40 µM, solución de oligoelementos SL10 1 ml/l, solución de selenato-tungstato 1 ml/l, Na2S 1 mM, resazurina 0,5 mg/l y glucosa 50 mM como sustrato catabólico en las DE. Los enriquecimientos de heces se cultivaron a 37 °C en medio mBHI modificado que contenía: 37 g/L de mezcla BHI (RPI), 200 mg/L de triptófano, 1 g/L de arginina, 5 mg/mL de menadiona, 500 mg/L de cisteína HCl, Solución de hemina 0,12 µg/mL [38], mucina 0,2 g/L, resazurina. Para enriquecimientos seleccionados, mBHI se complementó con componentes de medios adicionales (mBHI+) en función aproximadamente de las concentraciones añadidas a Gut Microbiota Medium (GMM) [38]: azúcares 3 mM (glucosa, celobiosa, maltosa, fructosa), acetato de sodio 30 mM, ácido propiónico, butirato de sodio 4 mM, lactato de sodio 15 mM, NaHCO3 30 mM.

Las densidades celulares se determinaron en función de la densidad óptica a 600 nm (OD600) utilizando un espectrofotómetro Ultraspec 2100 (GE Healthcare) o un lector de microplacas Tecan Infinite M1000. Los perfiles de glucosa y fermentación de las cepas de L. lactis se cuantificaron utilizando un cromatógrafo de líquidos de alta resolución Agilent 1260 Infinity como se describió anteriormente [39]. Para los experimentos de competición de L. lactis, las unidades formadoras de colonias se midieron en placas GM17 (NZ9000 + NZ9010) o GM17 + 5 ug/ml de eritromicina (NZ9010 solamente). El análisis de microscopía se realizó en un microscopio de fluorescencia Leica DM4000B-M utilizando ajustes de filtro FITC y de campo claro estándar.

La configuración de Dropception consta de cuatro bombas de jeringa para las fases del portador (Harvard Apparatus PicoPlus Elite), un estereoscopio (Amscope), una cámara de alta velocidad (ASI 174MM, ZWO) y una computadora de escritorio (HP). Los consumibles incluían tubos de PE-2, viales eppendorf o anaeróbicos para la recolección de gotas, componentes de medios y aceite HFE7500 + 2,2 % de Krytox iónico (FSH, Miller-Stephenson) [40]. La Tabla S2 contiene componentes detallados de la fase acuosa para todos los experimentos, pero brevemente, las fases celular e interna para los núcleos de gotas acuosas generalmente contenían medio de crecimiento de bacterias basales (LB, M9, CDM, mBHI), 0.5% BSA y cualquier sustrato catabólico indicado o tintes Se añadió 10 % de Optiprep (Sigma) a la fase celular como modificador de la densidad para garantizar tasas de flujo relativas iguales entre las fases interna y celular durante la generación de DE en vivo. Las células se diluyeron a una DO600 = 0,05 en la fase portadora de células para la carga de una sola célula (~20 % de las DE contienen una sola celda, ~2 % de las DE contienen 2 células) según una distribución de Poisson. Las fases de soporte acuosas externas contenían medios de crecimiento bacteriano coincidentes con el núcleo acuoso, Pluronix F68 al 2 % (Kolliphor P188, Sigma) y Tween-20 al 1 % (Sigma). Para los enriquecimientos anaeróbicos, todos los componentes se ensamblaron dentro de una cámara anaeróbica (COY) y todos los consumibles se dejaron en la cámara anaeróbica para eliminar el exceso de oxígeno al menos 3 días antes de su uso. Los moldes maestros del dispositivo Dropception para DE de 30 y 45 µm se diseñaron en AutoCAD 2019 y se fabricaron mediante fotolitografía multicapa en una sala limpia, como se describió anteriormente [33]. Los dispositivos Dropception PDMS se fabricaron mediante litografía blanda estándar de una capa en una mesa de laboratorio estándar, como se describió anteriormente [33]. Inmediatamente antes del uso, los canales exterior y de salida de los dispositivos PDMS se trataron selectivamente con plasma de O2 durante 12 minutos a 150 W en un limpiador de plasma Harrick PDC-001, se enjuagaron con PBS + Pluronic F68 al 2 %, se cubrieron con cinta adhesiva y se transfirieron en la cámara anaeróbica o configuración aeróbica. Las cuatro fases (aceite, celda, interior, exterior) se cargaron en jeringas (PlastiPak, BD) y se conectaron al dispositivo a través de un tubo PE/2 (Scientific Commodities). Las tasas de flujo típicas eran 300:100:105:6000 (aceite: celda: interior: exterior) µL h–1 para dispositivos de 45 µm de entrada doble y 275:85:2500 (aceite: interior: exterior) µL h–1 para dispositivos de entrada simple. -dispositivos de entrada de 30 µm. La generación de DE en vivo se monitoreó utilizando el estereoscopio y la cámara de alta velocidad dentro de la cámara anaeróbica.

DE-FACS se realizó como se describió anteriormente en un Sony SH800 [29, 33]. Brevemente, se diluyeron 50 µl de DE en 500 µl de tampón diluyente FACS (PBS + Tween-20 al 1 %) en un tubo FACS de fondo redondo de 5 ml, 12 × 75 mm (BD Biosciences). Después de la calibración automática estándar en el Sony SH800, los DE se resuspendieron suavemente antes de cargarlos y las gotas se analizaron en un chip microfluídico de 130 µm usando una configuración láser estándar de 408 nm. Los DE aparecen en el SH800 después de 2 a 3 minutos dentro de las puertas FSC-H y FSF-W específicas, seguidas de una activación posterior en la fluorescencia FITC cuando se indica para la clasificación (modo de rendimiento). Los ajustes de retardo de caída para la clasificación se calibraron manualmente como se describió anteriormente [33]; los ajustes óptimos de retardo de caída generalmente coincidían con los estimados por los ajustes autocalibrados de Sony SH800 para lograr una recuperación de >50 % de DE en placas de 96 pocillos para DE de 30 µm. Las tasas de eventos para el análisis FACS se mantuvieron por debajo de 1000 eventos/s y las tasas de clasificación se mantuvieron por debajo de 50 eventos/s. Los ajustes de ganancia para DE-FACS se describieron anteriormente [33], con la excepción de la ganancia FITC, que se fijó en 32 % o 40 % para E. coli GFP o células teñidas con SYTO, respectivamente. Los DE clasificados se depositaron en tubos FACS o placas de 96 pocillos precargados con 100 µL de solución exterior osmolaricamente equilibrada basada en componentes de medios del núcleo interno. Se tomaron imágenes de las poblaciones de DE clasificadas en un microscopio de fluorescencia Leica DM4000B-M y un microscopio de campo claro Leica DM E.

Los modelos matemáticos utilizados para simular los resultados competitivos de los especialistas en tasa frente a rendimiento se basaron en modelos Monod anteriores [41, 42], excepto que se eliminó el término de dilución para reflejar el crecimiento en cultivos por lotes alimentados y los parámetros cinéticos de crecimiento se basaron en determinados experimentalmente. las tendencias de crecimiento del monocultivo recopiladas previamente [26] y dentro de este estudio. Las ecuaciones diferenciales utilizadas en el modelo basal y las discusiones ampliadas se incluyen en los datos complementarios.

El programa MATLAB se personalizó para analizar imágenes del microscopio de fluorescencia Leica DM4000B-M (formato TIFF) con los ajustes de filtro FITC y de campo claro estándar superpuestos (F1C). Primero, MATLAB procesó cada imagen afinando los bordes de las gotas, identificando las coordenadas de cada gota a través de la función findcircles y recortando alrededor de cada gota. Luego, superpuso una máscara circular blanca del tamaño de los radios de cada gota para que solo los píxeles dentro de la gota se incluyeran en el recorte de la imagen. Los radios de las máscaras blancas se ajustaron para eliminar el exceso de límites de borde de gota (SF5). Luego, el código sumó todas las intensidades de píxeles por encima de un umbral determinado experimentalmente (datos no mostrados) dentro del interior de la gota. Este umbral se implementó para eliminar el exceso de píxeles negros, de modo que las gotas más grandes no arrojaran intensidades de píxeles sumadas más altas. El programa finalmente devolvió una tabla con todas las gotas indexadas y sus respectivas sumas de fluorescencia, que luego se analizó para relacionar el número de células con la fluorescencia.

El gDNA se preparó a partir de enriquecimientos de heces utilizando el kit Qiagen PowerSoil con la adición de un paso de incubación de 1 hora a 65 °C antes del batido. El servicio ZymoBIOMICS (Zymo Research, Irvine, CA) realizó y analizó la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA de muestras de gDNA. Zymo Research realizó la preparación de la biblioteca (Quick-16S rRNA amplicón del gen NGS Library Prep, D6400), el control de calidad posterior a la biblioteca, la secuenciación de lecturas finales emparejadas de 2 × 300 pb con una plataforma Illumina MiSeq y el análisis bioinformático con la canalización Dada2 y QIIME [43 , 44]. Se incluyó un estándar interno (ZymoBIOMICS Microbial Community DNA Standard D6305) para la preparación de bibliotecas como medida de control de calidad. Las lecturas sin procesar y los metadatos se enviaron a SRA bajo BioProject PRJNA852267.

Para encapsular células microbianas individuales para el cultivo paralelo de alto rendimiento en ED, basamos GrowMiDE en la plataforma microfluídica Dropception [33], que consiste en un dispositivo microfluídico simple de un solo paso, bombas de jeringa para las fases portadoras, una cámara de alta velocidad, y un estereoscopio (Fig. 1A, Fig. S4). Se generaron DE monodispersos de 30 o 45 µm de diámetro total, dependiendo respectivamente de la geometría del dispositivo, a ~1 kHz que contenían: HFE7500 + 2,2 % de Krytox iónico [40] como fase oleosa, medio de crecimiento basal + 2 % de pluronix F68 + 1 % Tween-20 como fase externa, y PBS o medio de crecimiento basal + BSA al 0,5% + sustratos catabólicos como fase celular e interna, respectivamente (Fig. 1A, B). Después de generar DE dentro del dispositivo de microfluidos, los recolectamos a granel para su incubación o análisis aguas abajo (Fig. 1B). Para garantizar que los DE contenían solo una celda después de la carga estocástica, operamos dentro de un régimen de Poisson en el que el 80 % de los DE estaban vacíos y el 98 % de los DE que contenían celdas contenían solo una celda (OD600 0,05 en la fase de portador de celda). La recolección de DE durante 4 h produjo ~ 48 millones de cultivos de microrreactor DE paralelos que contenían células individuales, lo que permitió una mayor encapsulación de especies de baja abundancia.

Para determinar si crecerían células individuales encapsuladas en DE, todas las DE se incubaron a granel y se evaluó el crecimiento microbiano en gotitas mediante microscopía de campo claro o de fluorescencia (Fig. 1C, D). La incubación durante la noche de DE que contenían células individuales de Escherichia coli que expresaban GFP de forma constitutiva dio como resultado DE que contenían 30-100 células (~ 5-7 generaciones), lo que indica un crecimiento robusto en gotitas no inhibidas por componentes de DE (Fig. 1C). GrowMiDE es compatible con el crecimiento microbiano aeróbico y anaeróbico; la configuración de Dropception es completamente operable dentro de una guantera anaeróbica (Fig. S4). Para demostrar estas capacidades, encapsulamos y cultivamos con éxito varios microbios facultativos y estrictamente anaeróbicos, incluidos E. coli MG1655 (que realizan fermentación ácida mixta), Lactococcus lactis spp cremoris NZ9000 (fermentación productora de ácido láctico), Desulfovibrio ferrophilus IS5 (reducción de sulfato) y el thermophile Thermoanaerobacter kivui (acetogénesis a 65 °C) (Fig. 1D). Estos resultados establecen que los DE son una plataforma adecuada de alto rendimiento para cultivar diversas especies microbianas.

Para cuantificar el crecimiento en DE, desarrollamos un script MATLAB personalizado para detectar automáticamente las intensidades por gota a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia (Fig. S5, S6). Usando E. coli que expresa GFP y este script automatizado, analizamos el crecimiento en DE que contienen glucosa o acetato en la fase interna como los únicos sustratos catabólicos (Fig. S7A). Crecimiento neto de E. coli-GFP en cultivos por lotes coincidentes de DE (Fig. S7B-D), lo que indica que los rendimientos de crecimiento de E. coli-GFP en GrowMiDE y cultivos por lotes son comparables. Juntos, estos datos demuestran que la plataforma GrowMiDE se puede utilizar para cultivar y cuantificar el crecimiento de diversas especies microbianas en alto rendimiento.

Luego usamos la plataforma GrowMiDE para cultivar células de una comunidad microbiana mixta. Nos enfocamos específicamente en el microbioma intestinal humano debido al conocimiento de los principales grupos metabólicos de microorganismos [45,46,47,48] y establecimos condiciones de medios que pueden cultivar muchos taxones diferentes [35, 49]. Específicamente, probamos si el cultivo GrowMiDE se enriqueció con nuevos taxones comparando los enriquecimientos microbianos realizados en cultivos por lotes o en DE (Fig. 2A) (Tabla S3). Brevemente, las muestras de heces se homogeneizaron, filtraron y centrifugaron para eliminar las partículas grandes y aislar las suspensiones celulares. Luego, las suspensiones celulares se diluyeron en mBHI a una concentración celular baja (OD600 ~ 0,05) para minimizar la posibilidad de encapsular más de 1 célula por DE a menos del 2 % de todos los eventos totales. La secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA reveló una composición de la comunidad microbiana claramente distinta en los enriquecimientos GrowMiDE en relación con las células cultivadas por lotes, incluso en el mismo medio basal (mBHI) (Fig. 2D). Si bien el número absoluto de especies recuperadas no difirió significativamente entre los enriquecimientos por lotes y GrowMiDE (Fig. 2B), las identidades únicas de los ASV enriquecidos fueron significativamente diferentes (Fig. 2C). Curiosamente, GrowMiDE produjo un crecimiento significativo único (6,0 ± 4,0 %, SD, 4/6 repeticiones) del metanógeno hidrogenotrófico intestinal Methanobrevibacter smithii, enriquecido desde ~0,4 % en la comunidad de heces de entrada correspondiente (Fig. 2D, Fig. S8A, C) . El aumento más sorprendente de un solo taxón en los enriquecimientos de GrowMiDE fue el enriquecimiento de Negativicutes Phascolarctobacterium faecium (17,8 ± 9,8 %, DE, 6/6 repeticiones), un aumento de 22 veces con respecto a la abundancia relativa en la comunidad de heces de entrada (0,8 ± 0,2%, DE, n = 5). (Fig. 2D, Fig. S8B,D). Los negativicutes son un grupo filogenético poco conocido con una estructura de envoltura celular única, y se cree que desempeñan un papel en la producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) críticos en el microbioma intestinal [50, 51]. Se desconoce el metabolismo in situ de P. faecium, pero se cree que su catabolismo primario es la fermentación secundaria (succinato a propionato) [52]. Sorprendentemente, P. faecium está presente en más del 67 % de las muestras de heces humanas [50]; sin embargo, es difícil de aislar y, por lo tanto, se incluyó en la lista de los "más buscados" del Human Microbiome Project [35].

Una descripción general esquemática de los enriquecimientos de heces en DE frente a los enriquecimientos por lotes en mBHI. B Diversidad alfa de heces de entrada, GrowMiDE y enriquecimientos por lotes basados en ASV únicos totales. Los gráficos de barras flotantes representan la media y el rango, n = 5–6. C Diversidad beta de heces de entrada, GrowMiDE y enriquecimientos por lotes según el tipo de ASV únicos. D Abundancia relativa de amplicón del gen 16 S rRNA de muestras de heces de entrada, enriquecimientos de GrowMiDE y enriquecimientos por lotes de suspensiones de células de heces. E Abundancia relativa de amplicón del gen 16 S rRNA de un curso temporal de enriquecimientos de heces en DE frente a cultivos discontinuos sacrificados a las 12, 24, 48 y 72 h, y correspondientes abundancias absolutas de amplicón del gen 16 S rRNA de (F) M. smithii (clase: Methanobacteria) y (G) P. faecium (clase: Negativicutes). Las explicaciones detalladas de las condiciones de enriquecimiento y los tipos de muestras en la Fig. 2D se describen en la Tabla S3.

En cultivos por lotes, la composición microbiana final se estableció principalmente dentro de las 12 h, de acuerdo con el crecimiento dominado por las especies más rápidas en un entorno de laboratorio artificial (p. ej., E. coli y Enterococcus spp) (Fig. 2E). Sin embargo, en los enriquecimientos de GrowMiDE observamos un enriquecimiento gradual y un aumento de las copias de genes de M. smithii y P. faecium a lo largo del tiempo (Fig. 2E–G). La aparición de estos taxones en momentos posteriores y su enriquecimiento a lo largo del tiempo respaldan la hipótesis de que la plataforma GrowMiDE disminuyó el sesgo contra las especies de crecimiento más lento y facilitó el enriquecimiento de nuevas fisiologías, incluso con un medio no selectivo.

Presumimos que los cultivos de heces GrowMiDE se enriquecieron para taxones de crecimiento más lento al minimizar la competencia por los nutrientes compartidos entre las gotas (es decir, la privatización de nutrientes). La privatización de nutrientes a través de la estructuración espacial promueve la diversidad en las comunidades, incluidos los microbios que priorizan el rendimiento de crecimiento sobre la tasa que de otro modo se perdería en los enriquecimientos de laboratorio (Fig. S1C). Las compensaciones entre especialistas en tasa y rendimiento han sido bien documentadas en cepas de Lactococcus lactis [26, 36] (Fig. 3A). En condiciones de alto flujo de glucosa, L. lactis de tipo salvaje (NZ9000) fermenta 1 mol de glucosa en 2 mol de lactato mediante fermentación homofermentativa de ácido láctico (Fig. S2A), lo que da como resultado un rendimiento neto de 2 mol de ATP por mol de glucosa. En condiciones de bajo flujo de glucosa, la fermentación se desplaza hacia la formación de etanol y acetato (Fig. S2B), lo que da como resultado una ganancia neta total de 3 mol de ATP por mol de glucosa. Este último metabolismo fermentativo está bloqueado en un mutante por deleción de lactato deshidrogenasa de L. lactis (∆ldhA, NZ9010). Aunque la cepa ∆ldhA tiene un mayor rendimiento de crecimiento, se compensa con una reducción de la tasa máxima de crecimiento (Fig. 3B). En elegantes experimentos de emulsión única, la encapsulación de las cepas WT y ∆ldhA resultó en el enriquecimiento de la cepa ∆ldhA eficiente, pero de crecimiento más lento, a través de las transferencias [26].

A Vías de fermentación de las cepas L. lactis WT (negra) y ∆ldhA (roja) en cultivos de lotes mixtos o enriquecimientos GrowMiDE. B Crecimiento de monocultivos y cocultivos de L. lactis (relación inicial 1:1) en CDM + glucosa 25 mM (n = 3, réplicas biológicas, las barras de error indican SEM). C Frecuencias de poblaciones a través de transferencias en cultivos de lotes mixtos de cepas de L. lactis en glucosa 50 mM. Cada transferencia recibió un inóculo al 1 % en CDM fresco + glucosa 50 mM, y se determinaron las CFU para cada cepa a partir de la comunidad cultivada en cada transferencia (n = 3, réplicas biológicas, las barras de error indican SEM). D Densidades celulares a través de transferencias en enriquecimientos GrowMiDE de cepas de L. lactis en glucosa 50 mM. El cultivo mixto inicial contenía ~80 % de ∆ldhA según lo determinado por UFC/mL en placas CDM + Ery5. Al final de cada transferencia, los DE se rompieron a granel mediante la incubación con 1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-1-octanol (PFO), se diluyeron a una OD = 0,05 para lograr la carga de una sola célula y las células se volvieron a -empaquetado en DE para la siguiente transferencia. (n = 3, repeticiones técnicas, las barras de error indican SEM). Las UFC para cada cepa se determinaron a partir de la comunidad cultivada en cada transferencia para determinar las densidades celulares relativas, y el cultivo mixto inicial contenía ~80 % de ∆ldhA antes de dividirse en experimentos de competición por lotes o DE. Todas las transferencias de L. lactis se incubaron durante 48 h a 30 °C.

Para probar si las DE mantuvieron de manera similar las poblaciones con un mayor rendimiento de crecimiento, competimos las cepas L. lactis WT y ∆ldhA en lote frente a los enriquecimientos GrowMiDE en transferencias en serie. Las tasas de crecimiento de los cocultivos por lotes que contenían una mezcla 1:1 de ambas cepas se parecían a la cepa WT más rápida (Fig. 3B), lo que coincidía con que WT constituía más del 80 % del cultivo después de la transferencia 0 (Fig. 3C). Como era de esperar, incluso cuando la cepa ∆ldhA se inoculó con una frecuencia alta del 80 %, la WT la superó en menos del 0,003 % en 2 transferencias en cultivo por lotes (Fig. 3C) [26]. Por el contrario, la población de ∆ldhA más lenta se mantuvo e incluso dominó WT en los enriquecimientos de GrowMiDE entre transferencias (99,33% de ∆ldhA por transferencia 4) (Fig. 3D), lo que demuestra que GrowMiDE puede retener o incluso enriquecer especies de crecimiento más lento de comunidades mixtas a través de privatización de nutrientes.

Una característica útil de las plataformas DE es la compatibilidad directa con la microscopía tradicional o FACS (DE-FACS) (Fig. 4A) [33, 34, 53, 54]. El desarrollo de una plataforma que facilite la encapsulación de alto rendimiento y la capacidad de aislar selectivamente las gotitas de interés tiene amplias aplicaciones que incluyen una mejor recuperación del genoma [55], ensayos de sensibilidad antimicrobiana [18, 56] y estudios de evolución dirigida [57]. Para probar si nuestras DE que contienen células pueden distinguirse y aislarse con precisión de las DE vacías mediante fluorescencia durante FACS, encapsulamos y cultivamos células de E. coli que expresan GFP en DE y luego intentamos aislar solo gotas que contienen células a través de FAC. FACS observó distintas poblaciones de FACS de DE vacías y cargadas de células, y las mediciones de microscopía fluorescente confirmaron que el 97,5 % de la población positiva clasificada contenía DE intactas cargadas con células (Fig. S9A). De acuerdo con los resultados de la microscopía, no pudimos diferenciar los DE vacíos de los cargados de células en función de la dispersión frontal o lateral durante FACS. También evaluamos si DE-FACS puede diferenciar entre DE vacíos y que contienen microbios agregando el tinte fluorescente SYTObc durante la encapsulación celular, abriendo las posibilidades para detectar y clasificar especies no tratables genéticamente. Una limitación de los enfoques basados en colorantes SYTO es el etiquetado diferencial de especies en concentraciones bajas (<1 µM) [58]; por lo tanto, optamos por utilizar SYTObc 2,5 µM, que contiene una mezcla de tintes basados en SYTO para aumentar las posibilidades de tinción celular universal. Identificamos puertas FACS que distinguían DE vacíos de DE que contenían E. coli MG1655 cargado con SYTObc 2,5 µM cultivado durante 24 h (Fig. S9B). Dentro de la población SYTO+ DE, el 92,2 % contenía células según lo confirmado por microscopía de campo claro basada en la detección de motilidad celular. Tiempos de incubación más largos disminuyeron la señal de fluorescencia; sin embargo, las poblaciones de SYTO+ DE aún eran detectables a las 48 h (Fig. 4C). En relación con el enriquecimiento GrowMiDE de entrada que contenía ~80 % de DE vacíos, DE-FACS dio como resultado un enriquecimiento de 443 y 419 veces para los DE que contenían E.coli-GFP y E.coli + SYTObc DE, respectivamente. Estos resultados demuestran la aplicación de DE-FACS para clasificar las gotas de DE que contienen células bacterianas cultivadas.

Una descripción general y aplicaciones potenciales para enriquecimientos microbianos utilizando GrowMiDE seguido de DE-FACS para obtener aislamientos. B Proporciones relativas de 4 cepas catabolizadoras de glucosa en una comunidad simulada enriquecida en cultivos por lotes o la plataforma GrowMiDE en CDM + glucosa 25 mM durante 48 h. n = 3. Las barras de error indican SEM. C Perfiles FACS de DE de 30 µm que contienen la comunidad simulada encapsulada con SYTObc 2,5 µM después de 48 h y posteriormente clasificada en pocillos individuales en una placa de 96 pocillos. Los pocillos de las placas se precargaron con medio de cultivo y 10 uL de PFO para interrumpir las DE. Se seleccionaron 767 eventos dentro del 2% superior de la población SYTO+ DE (38321 eventos) y 192 se clasificaron en placas para evaluar el crecimiento. D Curvas de crecimiento de 34 aislamientos de salida representativos aguas abajo de DE-FACS. Todos los ensayos de crecimiento se realizaron a 30 °C.

Una barrera importante en la microfluídica de emulsión única y la clasificación FACS tradicional de una sola célula es la dificultad de aislar células vivas para el análisis fenotípico posterior. Si bien los genomas de una sola célula a veces se pueden recuperar en procesos posteriores incluso si las células mueren [59, 60], preservar la viabilidad celular en poblaciones clasificadas es esencial para la caracterización posterior de la fisiología microbiana. Por lo tanto, el cultivo microbiano de alto rendimiento con GrowMiDE y los aislamientos posteriores con DE-FACS tienen el potencial de ser un enfoque poderoso para las pantallas, los enriquecimientos y los aislamientos (Fig. 4A). Como prueba de concepto, demostramos la aplicación de GrowMiDE + DE-FACS en una comunidad catabolizante de glucosa sintética que contiene E. coli, Pseudomonas putida, L. lactis WT y L. lactis ∆ldhA. Se eligió la comunidad sintética debido a (i) la compatibilidad de todas las especies en un medio definido, (ii) un uso catabólico de glucosa comparable y (iii) la capacidad de usar placas selectivas para evaluar fenotípicamente las identidades de especies de cultivos mixtos. E. coli dominó los enriquecimientos por lotes y GrowMiDE debido a una mayor tasa de crecimiento relativa y rendimientos en cultivos puros (Fig. S10); sin embargo, solo el cultivo GrowMiDE conservó las 4 cepas en la comunidad sintética (Fig. 4B, Fig. S11). Ilustrando cómo incluso las disminuciones menores en las tasas de crecimiento máximas pueden hacer que las especies se pierdan en cultivos por lotes, P. putida se perdió con frecuencia en competencias de cultivo por lotes después de 48 h a pesar de tener la segunda tasa de crecimiento y rendimiento más altos en monocultivos (Fig. S10). Para los enriquecimientos de GrowMiDE, clasificamos las DE individuales de la población de SYTO+ DE (Fig. 4C) en placas de 96 pozos, liberamos poblaciones clonales encapsuladas de las DE con PFO y recolectamos medidas de crecimiento de los aislamientos recuperados. Aquí, utilizamos incubaciones de 48 h a pesar de la disminución de las intensidades bacterianas teñidas y las puertas FACS más amplias resultantes para proporcionar tiempo suficiente para que todas las cepas crezcan en DE (Fig. 4C, Fig. S10). Nuestro enfoque incluía DE débilmente fluorescentes para limitar el sesgo en la eficiencia de tinción entre diferentes especies con la compensación de clasificar una fracción más alta de DE vacíos (Fig. 4C). En dos matrices de placas de 96 pocillos, 77 pocillos contenían bacterias recuperadas de DE clasificadas, 73 (95 %) de las cuales se confirmó que eran cultivos puros mediante placas selectivas para las 4 especies de entrada (Fig. 4D). De acuerdo con las abundancias de las 2 especies dominantes de los enriquecimientos de GrowMiDE (87 % E. coli: 12 % P. putida), el 79 % de los cultivos puros recuperados eran E. coli y el 16 % eran P. putida. Juntos, estos resultados demuestran la viabilidad de los enriquecimientos y aislamientos microbianos utilizando GrowMiDE + DE-FACS.

Aquí, demostramos una aplicación novedosa de la tecnología DE para cultivar microbios y realizar enriquecimientos de alto rendimiento para microbios de crecimiento más lento en comunidades definidas e indefinidas. Demostramos que muchas especies microbianas metabólicamente diversas pueden crecer en GrowMiDE, incluidos los anaerobios estrictos (Fig. 1). Además, GrowMiDE también puede facilitar el enriquecimiento de los microbios que persiguen una estrategia de rendimiento de crecimiento sobre la tasa de crecimiento (Fig. 3D). Los enriquecimientos de GrowMiDE produjeron de manera única especies microbianas que nunca se observaron en cultivos por lotes usando el mismo medio de enriquecimiento (Figs. 2, 4). Finalmente, demostramos la aplicación de GrowMiDE y DE-FACS como plataforma para obtener aislamientos para la caracterización posterior y los estudios fisiológicos (Fig. 4).

En nuestro estudio, la privatización de nutrientes permitió que las especies de crecimiento lento escaparan de la competencia [1, 2]. Aunque los DE separan espacialmente las células y las macromoléculas grandes en microrreactores separados, el núcleo acuoso interno solo está separado del medio ambiente por una fina capa de aceite. Dependiendo de los tensioactivos locales y los agentes de bloqueo utilizados en la capa de aceite, los DE pueden ser selectivamente permeables a moléculas pequeñas, incluido el oxígeno, las sales y algunos colorantes [30,31,32, 61]. Se informa que este efecto es ajustable dependiendo de las propiedades y concentraciones del tensioactivo [61]. Otros estudios reológicos en DE también han demostrado que la rodamina A, los conjugados de BSA y la anhidrotetraciclina pueden atravesar la capa de aceite en un sistema de suministro mediado por el pH en algunas formulaciones de DE [31]. Se desconoce el mecanismo molecular del entrecruzamiento, aunque se ha planteado la hipótesis de difusión facilitada y emulsificación espontánea [31, 62].

Si bien es posible que se produjeran niveles bajos de cruce de fuentes de carbono dentro de nuestros enriquecimientos GrowMiDE, los niveles de glucosa retenidos dentro de los DE siguieron siendo suficientes para favorecer el crecimiento de mutantes L. lactis ∆ldhA de crecimiento lento (Fig. 3D). Los grados de privatización de nutrientes pueden ser dinámicos; incluso la privatización parcial, en la que existe una competencia limitada, puede ser suficiente para preservar distintas poblaciones [63,64,65]. Otra posibilidad es que la baja permeabilidad de los DE para ciertos compuestos podría haber facilitado el crecimiento de M. smithii y/o P. faecium. Se ha indicado que P. faecium y M. smithii son totalmente dependientes de metabolitos alimentados de forma cruzada de la comunidad intestinal, succinato y H2, respectivamente; sin embargo, ninguno de los compuestos se agregó a los enriquecimientos de GrowMiDE. El H2 es producido durante la fermentación por muchas especies intestinales co-enriquecidas y debería difundirse fácilmente a través del aceite HFE7500. No pudimos detectar H2 en los espacios de cabeza de los enriquecimientos de DE, pero es posible que el H2 estuviera por debajo del límite de detección (<10 ppm), especialmente si M. smithii lo consumió rápidamente. Debido al pequeño volumen de muestra en los enriquecimientos con DE (<500 µL), no pudimos medir el CO2; sin embargo, las incubaciones con DE complementadas con bicarbonato de sodio 30 mM (mBHI+) o sin (mBHI) produjeron enriquecimientos similares de M. smithii. Para los enriquecimientos de P. faecium, no está claro cómo las concentraciones picomolares de cruce de succinato de una subsección de una comunidad mixta promoverían un enriquecimiento significativo. El análisis completo de la secuencia del genoma de las dos cepas de P. faecium aisladas existentes sugiere que la fermentación de succinato a propionato es su único catabolismo primario [66]. Sin embargo, es posible que el enriquecimiento GrowMiDE facilitara el uso de otros sustratos catabólicos que estaban disponibles en nuestros enriquecimientos, ya sea en el medio basal mBHI o producido por otra especie. Se ha sugerido que P. faecium participa en la alimentación cruzada de vitamina B12 con Bacteroidetes [67]. Los enriquecimientos de cultivo por lotes de control complementados con componentes de DE no enriquecieron para P. faecium (datos no mostrados), lo que descarta la posibilidad de catabolismo de aceite o tensioactivos de DE.

A pesar del enriquecimiento significativo de las abundancias relativas de especies de crecimiento más lento en nuestros enriquecimientos de microbioma intestinal, no pudimos aislar con éxito P. faecium. Múltiples intentos de aislamiento en el transcurso de un año no lograron producir aislamientos de P. faecium, incluida la incapacidad de reproducir el aislamiento previo exitoso de P. faecium en placas de medio anaeróbico de chocolate o Gifu [50, 66]. Debido a la fisiología desconocida de nuestro P. faecium que crece en medios sin succinato en DE y la posibilidad de alimentación cruzada, sospechamos que no pudimos recapitular condiciones de crecimiento similares en placas sólidas con colonias aisladas. Intentamos usar DE-FACS para aislar P. faecium directamente en cultivos líquidos, sin embargo, la señal de SYTObc fue demasiado baja después de incubaciones de más de 48 h para distinguir claramente las gotas vacías de las llenas en condiciones anaeróbicas. Por lo tanto, la aplicación exitosa de DE-FACS para obtener P. faecium está actualmente limitada por la falta de colorantes altamente fluorescentes que funcionen en condiciones totalmente anaeróbicas. Recientemente, ha habido un trabajo prometedor en la creación de proteínas indicadoras fluorescentes anaeróbicas [68, 69], pero los fisiólogos microbianos se beneficiarían enormemente de la creación de tintes fluorescentes anaeróbicos para sistemas no tratables genéticamente. Además de la falta de opciones fuertes de colorantes fluorescentes, es probable que algunos anaerobios estrictos, incluido posiblemente P. faecium, no sobrevivan a la exposición transitoria al oxígeno durante la clasificación en un instrumento FACS comercial. Sin embargo, existen cámaras de clasificación anaeróbicas personalizadas en los instrumentos FACS [70, 71] y algunos anaerobios estrictos se han recuperado con éxito después de la clasificación [72].

Los avances recientes en la tecnología de microfluidos para ampliar el número de especies cultivadas incluyen dispositivos personalizados para aislar e incubar células individuales (iChip, SlipChip) [73,74,75] y culturómica, en la que las colonias bacterianas se disponen en diferentes condiciones de medios en placas y se identifican mediante MALDI-TOF [49]. Sin embargo, estas tecnologías tienen un rendimiento limitado y requieren equipos especializados y costosos para analizar y clasificar cultivos cultivados. La plataforma de enriquecimiento GrowMiDE es muy adecuada para diversas aplicaciones y solo requiere instrumentación simple, todo lo cual se puede ensamblar y operar con una capacitación mínima. En este estudio, demostramos que GrowMiDE eliminó la competencia con microbios de crecimiento más rápido y microbios enriquecidos de una comunidad mixta que se pierde categóricamente en cultivos por lotes en las mismas condiciones de medios (Fig. 4). Además de usar GrowMiDE como herramienta de enriquecimiento de alto rendimiento, estamos entusiasmados con la perspectiva futura de usar DE-FACS como herramienta de detección para comunidades aeróbicas indefinidas. El desarrollo de métodos de enriquecimiento de alto rendimiento como ese no favorece a los microorganismos de crecimiento rápido y son compatibles con los equipos FACS comúnmente disponibles podría servir como un enfoque novedoso para combatir la "anomalía del gran recuento de placas".

Todos los datos sin procesar y los scripts de Matlab están disponibles gratuitamente para cualquier investigador que los solicite. Los datos de secuenciación del amplicón del gen 16 S rRNA se han enviado a SRA bajo BioProject PRJNA852267.

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Descargar referencias

Agradecemos a H. Bachmann por las cepas de L. lactis NZ9000 y NZ9010, ya A. Maheshwari por la cepa de E. coli-GFP [76]. También agradecemos a los miembros del equipo Dropception del laboratorio de Fordyce y al laboratorio del Prof. A. Bhatt por sus útiles debates sobre los experimentos. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias de EE. UU. a través del Centro para Investigaciones de Biosfera de Energía Oscura Profunda, NIH 1DP2 GM123641 otorgado a PMF, y una Beca Postdoctoral Simons en Ecología Microbiana Marina a AL McCully de la Fundación Simons, División de Ciencias de la Vida , premio #600755. PMF es un investigador de Chan Zuckerberg Biohub.

Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Alexandra L. McCully y Alfred M. Spormann

Departamento de Ingeniería Química, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Circuito McKenna Yao y Alfred M. Spormann

Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad de California, Berkeley, CA, EE. UU.

Bucle McKenna Yao

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Kara K. Brower y Polly M. Fordyce

Departamento de Genética, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

polly m fordyce

Instituto ChEM-H, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

polly m fordyce

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, EE. UU.

polly m fordyce

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investigación diseñada por ALM, AMS y PMF; ALM y MLY realizaron investigaciones; KKB y PMF contribuyeron con nuevos reactivos/herramientas analíticas; datos analizados de ALM, MLY, PMF y AMS; y ALM, PMF y AMS escribieron el artículo.

Correspondencia a Alfred M. Spormann.

Los métodos y técnicas descritos en este trabajo se describen en una solicitud de patente de EE. UU., solicitud de PTO de EE. UU. n.º 62/693800, presentada por los coautores KK B, SK y PMF

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Reimpresiones y permisos

McCully, AL, Loop Yao, M., Brower, KK et al. Emulsiones dobles como plataforma de enriquecimiento y aislamiento de alto rendimiento para microbios de crecimiento lento. ISME COMÚN. 3, 47 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00241-9

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Recibido: 22 noviembre 2022

Revisado: 27 de marzo de 2023

Aceptado: 12 abril 2023

Publicado: 09 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00241-9

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