Estructura - Grupo Co., Ltd de los laboratorios de minería de Foshan

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 7724 (2022) Citar este artículo

2175 Accesos

2 citas

1 Altmetric

Detalles de métricas

Un paso esencial en la transformación bacteriana es la captación de ADN en el periplasma, a través de la gruesa pared celular de peptidoglicano de las bacterias Gram-positivas, o la membrana externa y la delgada capa de peptidoglicano de las bacterias Gram-negativas. ComEA, una proteína de unión al ADN ampliamente conservada en bacterias transformables, es necesaria para este paso de captación. Aquí determinamos las estructuras cristalinas de rayos X de ComEA de dos especies Gram-positivas, Bacillus subtilis y Geobacillus stearothermophilus, identificando un dominio que está ausente en las bacterias Gram-negativas. Los análisis cristalográficos, genéticos y de ultracentrifugación analítica (AUC) de rayos X revelan que este dominio impulsa la oligomerización de ComEA, que mostramos es necesaria para la transformación. Utilizamos AUC de múltiples longitudes de onda (MW-AUC) para caracterizar la interacción entre el ADN y el dominio de unión al ADN de ComEA. Finalmente, presentamos un modelo para la interacción del dominio de unión al ADN de ComEA con el ADN, lo que sugiere que la oligomerización de ComEA puede proporcionar una fuerza de tracción que impulsa la captación de ADN a través de las gruesas paredes celulares de las bacterias Gram-positivas.

La competencia natural para la transformación es un mecanismo de transferencia horizontal de genes muy extendido tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas, así como en algunas arqueas (para revisiones ver 1,2). El proceso de transformación consta de dos pasos principales: absorción y transporte (Fig. 1A). La captación es el movimiento del ADN transformador ambiental (tDNA) hacia el periplasma, a través de la gruesa pared celular de peptidoglicano de las bacterias Gram-positivas o la membrana externa y la delgada capa de peptidoglicano de las bacterias Gram-negativas. El transporte es la translocación posterior de tDNA monocatenario desde el periplasma al citoplasma donde puede recombinarse con el cromosoma para generar un transformante. Los estudios de estructura-función presentados aquí se centran en el primer paso, la captación de ADN.

A El tpilus está compuesto por ComGC, cuyo montaje requiere de la ATPasa ComGA. Se cree que el tpilus está anclado a la proteína de membrana ComGB. El tpilus se une débilmente al ADN y se retrae para llevarlo al periplasma. Aquí, el ADN se encuentra con ComEA, que estabiliza la unión a la célula e impulsa la captación continua del ADN. Se propone ComEC para degradar una hebra de ADN y proporcionar el canal para el transporte de ADN al citoplasma. Arquitectura del dominio B de ComEA de una bacteria Gram-positiva representativa, B. subtilis. Arquitectura del dominio C de ComEA de una bacteria Gram-negativa representativa, V. cholerae. Los residuos 1–24 no se muestran para resaltar el hecho de que comprenden una señal de secreción predicha que se escinde para generar ComEAVc madura, que se difunde libremente en el periplasma. TM, región transmembrana predicha. La línea magenta denota una región de función desconocida, que se aborda en este estudio. HhH, motivos hélice-horquilla-hélice. La numeración de residuos corresponde a ComEABs o ComEAVc. Los elementos de la figura fueron creados con BioRender.com.

La captación se inicia en la superficie celular cuando el tDNA interactúa con un pilus de transformación (tpilus). Después de este contacto con el tpilus, el movimiento de tDNA hacia el periplasma es impulsado por su interacción con la proteína periplásmica ampliamente conservada ComEA (Fig. 1A). ComEA, se descubrió en las pantallas genéticas para la deficiencia de transformación en Bacillus subtilis. Posteriormente se demostró que era una proteína de unión a ADN no específica requerida tanto para la unión estable de tDNA a la célula como para la captación de tDNA3,4. En B. subtilis y otras bacterias Gram-positivas, ComEA está unido a la membrana por una región transmembrana N-terminal4. Este ancla de membrana y un dominio de unión a ADN C-terminal están separados por una región de función desconocida que consta de ~110 aminoácidos (Fig. 1B). En marcado contraste, ComEA en los Gram-negativos contiene solo un único dominio de unión al ADN (independiente) que puede difundirse libremente en el periplasma5,6,7 (Fig. 1C).

Tanto en bacterias gramnegativas como positivas, a excepción de Helicobacter pylori8, la captación la inician los pili tipo 4 que se unen al ADN y se retraen, tirando de un segmento de ADN transformante hacia el compartimento periplásmico9,10. Se ha propuesto que en los gramnegativos Vibrio cholerae y Neisseria gonorrhoeae, el ComEA de un solo dominio se une a este segmento de ADNt introducido, evitando la pérdida de ADNt por difusión hacia atrás a través de la membrana externa6,11. Por lo tanto, el pilus inicia la captación mientras que ComEA funciona como un trinquete browniano12, proporcionando la fuerza impulsora para la captación de la mayor parte del tDNA en el periplasma. En todas las bacterias, después de la absorción por el periplasma, se degrada una hebra de tDNA y la hebra restante se transporta al citoplasma a través del canal de membrana ComEC (revisado en 1,2). En Gram-positivos, la ATPasa ComFA asociada a la membrana y su proteína asociada ComFC parecen proporcionar la energía para el transporte. No se han identificado proteínas Gram-negativas equivalentes.

La estructura compleja y el anclaje a la membrana de ComEA en los grampositivos sugiere que puede actuar de manera diferente al mecanismo de trinquete browniano simple propuesto para V. cholerae y N. gonorrhoeae. Para investigar esta estructura compleja y obtener información sobre su modo de acción, llevamos a cabo una investigación de estructura-función in vitro e in vivo, centrada en la proteína B. subtilis. Aquí presentamos estructuras cristalinas de rayos X de ComEA de B. subtilis (ComEABs) y Geobacillus stearothermophilus (ComEAGs) junto con análisis genéticos y biofísicos complementarios. Estos estudios revelan que el dominio de unión al ADN es un dominio de hélice-horquilla-hélice atípico y, lo que es más importante, que un dominio previamente no identificado se encuentra dentro de la región Gram-positiva ComEA de función desconocida. Mostramos que este dominio impulsa la oligomerización de ComEA y que la oligomerización es necesaria para la transformación genética. Postulamos que el papel inesperado de la oligomerización de ComEA en la captación de ADN se explica por la condensación de proteína de ADN que proporciona una fuerza impulsora para la captación de ADNt a través de la gruesa pared celular de las bacterias Gram-positivas.

Para obtener una visión mecánica de la función de ComEA, clonamos, sobreexpresamos, purificamos y determinamos las estructuras cristalinas de rayos X de ComEAB y ComEAG con una resolución de 3,20 Å y 3,05 Å, respectivamente (Figs. 2A, 2B y Tabla S1). No se evidenció densidad de electrones para el dominio de unión al ADN de ComEAB o la región enlazadora, pero hubo una densidad clara correspondiente a un dominio no descrito previamente (aminoácidos 60–122) (Fig. 2A). Hay siete de estos dominios dispuestos de cabeza a cola en la unidad asimétrica cristalográfica de ComEAB, y llamamos a esta región dominio de oligomerización (OD) (Fig. 2A).

A) Estructura cristalina de rayos X de ComEAB. Se muestra una unidad asimétrica que contiene siete protómeros. Las flechas aquí apuntan a solo tres de las seis interfaces de multimerización en la unidad asimétrica. B) Estructura cristalina de rayos X de ComEAG. Se muestra una unidad asimétrica que contiene dos protómeros.

A diferencia de los ComEAB, en la estructura de los ComEAG había una densidad de electrones interpretable correspondiente no solo a la OD (aminoácidos 62–124) sino también a un dominio de unión al ADN (aminoácidos 143–207) por unidad asimétrica, que contenía dos OD. protómeros nuevamente dispuestos de cabeza a cola (Fig. 2B). Debido a que no existe una densidad de electrones interpretable correspondiente a la región enlazadora de ComEAG (aminoácidos 125–142) de ninguno de los protómeros, se desconoce cuál de los monómeros OD en el dímero OD de la unidad asimétrica se conecta al dominio de unión al ADN modelado único. De hecho, pudimos modelar el dominio de unión al ADN en la estructura de ComEAG solo porque hizo contactos cristalinos fortuitos. Concluimos a partir de las estructuras de ComEA que el dominio enlazador es flexible, que hay contactos mínimos entre el OD y los dominios de unión al ADN, y que los OD tienen el potencial de formar multímeros en solución.

Notamos que la multimerización de OD se extiende más allá de la unidad asimétrica (Fig. 2A, B). Más específicamente, en la estructura ComEABs, la unidad asimétrica de siete miembros utiliza la interfaz de multimerización OD para formar un anillo de cabeza a cola de 14 miembros alrededor del eje cristalográfico doble (Fig. 3A, B). De manera similar, en la estructura de ComEAG, el examen de las parejas de simetría revela que la unidad asimétrica de dos miembros usa la interfaz de multimerización de OD para formar una espiral de anillo retorcido a lo largo del eje del tornillo cristalográfico, que contiene 12 protómeros de cabeza a cola por vuelta (Fig. 3C,D). Una ligera inclinación entre los protómeros de ComEAG (Fig. S1) tiene efectos mínimos en los enlaces entre dímeros de ComEA, pero hace que los ComEAG formen un anillo retorcido en lugar de un anillo cerrado dentro de los cristales.

A y B Vistas frontal y lateral del anillo cristalográfico ComEABs, respectivamente. C y D Vistas frontal y lateral del anillo retorcido cristalográfico de ComEAG, respectivamente. E Representación esquemática de la interfaz de multimerización de ComEAG. Las cadenas A y B de ComEA se representan como enlaces azules y marrones, respectivamente. Los enlaces de hidrógeno se representan como líneas discontinuas verdes. Los contactos hidrófobos se representan como líneas que irradian desde los semicírculos y las esferas. El esquema fue producido con LigPlot+50.

Los aminoácidos de la interfaz de oligomerización de ComEA se conservan (Fig. S2) y median interacciones intermoleculares conspicuas entre los dominios OD de los protómeros de ComEA, por ejemplo, las cadenas laterales de ComEAG Arg85 y Asp113 (correspondientes a ComEAB Arg83 y Asp111) que forman puentes salinos intermoleculares, ( figura 3E). Esto sugirió que ComEA puede oligomerizar no solo en los cristales sino también en solución y procedimos a explorar esta posibilidad.

Para confirmar que la DO observada en ambas estructuras cristalinas de rayos X de ComEA mediaba la autoasociación reversible en solución, analizamos diferentes concentraciones de ComEAG utilizando ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación (SV-AUC)13. A 10,3 μM, la mayoría de ComEAG tiene un coeficiente de sedimentación de 1,6 S, consistente con el monómero ComEA. Sin embargo, a 157 μM, la mayoría de los ComEAG tienen un coeficiente de sedimentación de 2,2 S, lo que sugiere una dimerización reversible en función de la acción de la masa (Fig. 4A). A una concentración intermedia de 31,3 μM, observamos tanto el monómero como el dímero, y pudimos ajustar los datos de velocidad de sedimentación a un modelo discreto de equilibrio de monómero-dímero13, lo que resultó en una Kd de 33,8 μM (intervalos de confianza del 95 %: 19,3 μM, 48,4 μM ) (Cuadro S4). La aparente afinidad de dimerización de ComEA es probablemente una subestimación de su afinidad de dimerización in vivo, porque la difusión de ComEA in vivo está limitada a dos dimensiones en la membrana celular.

A Superposiciones de distribución del coeficiente de sedimentación integral que comparan el potencial de dimerización de ComEAG a 10,3 μM (rojo) y 157 μM (verde) y ComEAGs-A108Y a 11,3 μM (azul) y 124 μM (negro). Solo ComEAGs se dimeriza a mayor concentración, mientras que ComEAGs-A108Y permanece monomérico. B Superposiciones de distribución del coeficiente de sedimentación integral de la DO de los ComEAG a 12,7 μM (magenta) y 196 μM (naranja), que muestran una autoasociación reversible. C Estructura de ComEAG con la cadena A representada como una caricatura y la cadena B representada como una superficie. La cadena A Ala108 de ComEAG fue mutada a Tyr y se representa como barras magenta.

De acuerdo con el análisis SV-AUC de ComEAGs, una proteína ComEAGs truncada que consta de OD solo (ComEAGs-OD) también se multimerizó en solución (Fig. 4B). Sin embargo, ComEAGs-OD formó principalmente monómeros y dímeros a baja concentración (12,7 μM) y oligómeros más grandes con una masa molar máxima de alrededor de 100 kDa a alta concentración (196 μM) (Fig. S3). Una posible explicación cinética para los diferentes estados multiméricos de ComEAG y ComEAG-OD en concentraciones similares es que la presencia del dominio de unión al ADN de ComEAG ralentiza la búsqueda de multimerización de OD, lo que limita las colisiones y, por lo tanto, ralentiza la tasa de multimerización de OD (kon).

Para confirmar que la multimerización de ComEA está impulsada por la OD, examinamos las estructuras cristalinas de rayos X para identificar un pequeño aminoácido enterrado en la interfaz de multimerización de OD que podríamos reemplazar con un aminoácido más grande, introduciendo volumen estérico e interrumpiendo la multimerización. Identificamos ComEAGs Ala108 (correspondiente a ComEABs Ala106) y lo sustituimos con tirosina (Figs. 3E, 4A, C y S4). De hecho, ComEAGs-A108Y era monomérico tanto en 11,3 μM como en 124 μM (Fig. 4A). Estos experimentos SV-AUC demuestran que la OD impulsa la multimerización de ComEA en solución como se predijo a partir de las estructuras cristalinas de rayos X.

Especulamos además que la multimerización de ComEA juega un papel importante en su interacción con el ADN. Para probar esto, utilizamos ultracentrifugación analítica de longitud de onda múltiple (MW-AUC)14,15,16,17 para medir la unión de ComEAG de tipo salvaje y ComEAG-A108Y al ADN. MW-AUC es una técnica novedosa que permite la separación espectral de especies de proteínas y ADN en función de sus espectros de absorbancia únicos. En consecuencia, es posible medir la estequiometría molar de los complejos formados e identificar el tipo de macromolécula(s) que forman cada especie hidrodinámica. Las medidas hidrodinámicas dependen de la masa molar y el radio hidrodinámico de cada especie.

Para dilucidar las interacciones entre ComEA y el ADN de doble cadena, mezclamos ComEA de tipo salvaje y mutante con un dúplex de ADN de doble cadena de 14 pb en un exceso de proteína molar de 5: 1 y 10: 1 y un exceso de proteína de 10: 1 sobre un dúplex de ADN de doble cadena de 40 pb (Fig. 5A-C y Tabla S2). En todos los casos, la concentración de ADN se mantuvo constante a 1,5 μM y se formó un complejo bien definido, con menos del 10% del ADN restante libre en la solución. El patrón de sedimentación de ADN desconvolucionado sugiere la presencia de un complejo homogéneo saturado que se forma en todos los casos. Como se esperaba, el ADN secuestró el exceso de proteína hasta que estuvo completamente ocupado, y la secuencia de 14 pb acomodó menos moléculas de ComEA que la secuencia de 40 pb.

Mezclas A y B Proporciones molares de 5:1 y 10:1 de ComEAG de tipo salvaje y ComEAG-A108Y con la molécula de ADN de 14 pb, respectivamente. Aquí, las señales de ADN aún sugieren una saturación total con proteína, pero las señales de proteína muestran distribuciones de coeficientes de sedimentación más heterogéneas, consistentes con un intercambio más rápido con el complejo proteína-ADN, lo que sugiere una tasa de koff más rápida. Más del 90 % del ADN está complejado con proteína, cambiando la distribución de ADN de 14 pb de 2,0 S para el control solo a 3,3 S para el mutante y 3,9 S para el tipo salvaje en el panel A. En el panel B, aumentando la concentración de proteína a 10:1, desplaza marginalmente la sedimentación de ADN para el tipo salvaje más a aproximadamente 4,0 S, mientras que apenas afecta la sedimentación de ADN cuando se mezcla con el mutante. C Superposiciones de distribución del coeficiente de sedimentación integral para las señales de proteína y ADN desconvolucionadas de la mezcla 10:1 de ComEAG y ComEAG-A108Y con 1,5 μM de la molécula de ADN de 40 pb. ComEA sin unir en presencia de cosedimentos de ADN con ComA en ausencia de ADN. Nuevamente, más del 90 % de la señal de ADN cambia de la posición de ADN libre de 40 pb a los 3,3 s a una composición homogénea a 6,3 S para el mutante y 8,1 S para el tipo salvaje, lo que sugiere una saturación del ADN con ComEA. La señal de ComEA sigue de cerca la señal de ADN, lo que sugiere una formación compleja estrecha con una tasa de koff lenta. Para todos los gráficos, los controles de referencia de cada molécula por sí misma se muestran como círculos (ComEA: círculos rojos, ComEA-A108Y: círculos azules, ADN de 14 o 40 pb, como se indica: círculos verdes), los símbolos para las interacciones entre el ADN y la proteína de tipo salvaje son se muestran como cuadrados (señal ComEA: cuadrados naranjas, señal de ADN: cuadrados verde oscuro) y las interacciones entre ComEA-A108Y y el ADN se muestran en triángulos (señal ComEA-A108Y: triángulos verde oliva, señal de ADN: triángulos azul claro).

El coeficiente de sedimentación del complejo difería para el tipo salvaje y el mutante y dependía de la longitud del ADN. El dúplex de ADN de doble cadena de 14 pb sedimentó a 2,0 S de forma aislada, pero formó un complejo de 3,3 S con ComEAGs-A108Y y un complejo de 3,9 S con ComEAG de tipo salvaje en la mezcla 5:1 (Fig. 5A). Para esta mezcla, medimos una proporción de ~3:1 proteína:ADN para el complejo formado con ComEAG y una proporción de ~2:1 para el complejo formado con la proteína ComEAGs-A108Y. Para la mezcla de proteína:ADN 10:1, se formó un complejo de 3,5 S ligeramente más grande con ComEAGs-A108Y, se formó un complejo de 4,0 S con ComEAG de tipo salvaje y las proporciones de proteína:ADN no cambiaron significativamente (Fig. 5B) .

El ADN de 40 pb sedimenta a 3,3 S cuando se examina solo, pero cuando se mezcla en una proporción de 10:1 con ComEAGs-A108Y da como resultado un complejo de 6,3 S, mientras que la misma mezcla con ComEAG de tipo salvaje da como resultado un complejo de 8,1 S (Figura 5C). Para el ADN de 40 pb, la diferencia entre las proporciones molares proteína:ADN de los complejos formados fue más pronunciada entre el tipo salvaje y el mutante. Los ComEAG de tipo salvaje mostraron una proporción de aproximadamente 7:1, pero el complejo entre el ADN y ComEAGs-A108Y sugirió la presencia de una proporción de aproximadamente 4,7:1. Si bien la precisión de estas proporciones depende de los coeficientes de extinción molar estimados en los complejos formados, existe una clara diferencia en la cantidad de ComEA unido al ADN para las proteínas mutantes y de tipo salvaje.

En resumen, estos resultados sugieren que ComEA de tipo salvaje, capaz de oligomerizar, forma complejos más grandes con el ADN que el mutante A108Y. La oligomerización facilita el empaquetamiento eficiente y cooperativo de ComEA en el ADN, que está respaldado por el análisis de cambio de gel (detallado a continuación).

La conservación en bacterias Gram-positivas tanto del propio dominio ComEA OD como, significativamente, de los residuos enterrados en la interfaz de multimerización (Figs. S2 y 3E), nos llevó a plantear la hipótesis de que la OD es importante para la transformación. Medimos esto in vivo comparando la transformación de B. subtilis en cepas que contenían ComEAB de tipo salvaje; ComEABs-D111N, que interrumpe un puente salino intermolecular conservado entre D111 y R83 (correspondiente a ComEAGs Asp113 y Arg85, Fig. 3E); ComEABs-A106Y (correspondiente a ComEAGs-A108Y), que, como se muestra arriba, bloquea estéricamente la multimerización OD (Fig. 4A, C); y ComEA-ΔOD, que contiene una deleción de todo el OD, mientras deja intactos tanto la región transmembrana como el dominio de unión al ADN. En comparación con ComEAB de tipo salvaje, ComEABs-D111N redujo la transformación de B. subtilis casi 100 veces (Fig. 6A). Aún más llamativas fueron las mutaciones ComEABs-A106Y y ComEA-ΔOD que redujeron la transformación de B. subtilis unas 1000 veces, un fenotipo equivalente al de una deleción completa de comEA. El análisis de transferencia Western mostró que las proteínas ComEA de tipo salvaje y mutantes se expresaron de manera similar en B. subtilis (Fig. 6B). Para determinar si el mutante deficiente en oligomerización A106Y ejerce su efecto sobre la transformación al evitar la captación de ADN en el periplasma, utilizamos ADNt marcado con rodamina, que puede incorporarse en el periplasma pero no puede atravesar la membrana celular18. Como se muestra en la (Fig. 6C), la mutación A106Y impide la asociación estable del ADN con las células que expresan competencia, que hemos demostrado previamente que requería la captación en el periplasma18. Concluimos que la oligomerización ComEA juega un papel inesperado y necesario en la transformación de B. subtilis y probablemente también de otras bacterias Gram-positivas.

Todas las mutaciones se introdujeron en el cromosoma de BD9007, que lleva una fusión específica de competencia de una secuencia que codifica la proteína fluorescente cian (CFP) expresada a partir del promotor de comG, colocada en el locus amyE ectópico para permitir la identificación de células que expresan competencia por microscopía de epifluorescencia. Los experimentos de transformación se realizaron como triplicados biológicos y las frecuencias promedio, normalizadas a los valores de tipo salvaje, se trazan como gráficos de barras en el panel A con los puntos de datos incluidos. El mayor número de puntos de datos para el control de tipo salvaje refleja la inclusión de esta cepa en las tres réplicas biológicas. Los valores medios normalizados con desviaciones estándar para los mutantes fueron 0,0012 ± 0,00047 (ΔOD), 0,0,0005 ± 0,00024 (A106Y), 0,11 ± 0,03 (D111N). Los valores de p se determinaron mediante pruebas t bilaterales. El panel B muestra transferencias de Western para los correspondientes extractos mutantes y de tipo salvaje usando antisuero anti-GFP. Se incluyeron extractos de ΔcomEA como controles para la identidad de las señales de ComEA. El panel C muestra imágenes epifluorescentes típicas del tipo salvaje (BD9007) y su equivalente mutante isogénico A106Y, después de la transformación con ADN del bacteriófago lambda marcado con rodamina durante 45 minutos. Las células que expresan competencia se identificaron mediante fluorescencia CFP (cian pseudocoloreada) y las señales de rodamina-tDNA asociadas a células detectables están rodeadas por un círculo. Para el tipo salvaje, 13 de 42 células exhibieron al menos un punto rojo, mientras que para las 23 células mutantes solo se observó un punto asociado a la célula apenas detectable. Las grandes manchas rojas en el panel inferior no están asociadas con las células y se deben a la contaminación de material fluorescente de origen desconocido. La barra de escala en la parte inferior izquierda de la imagen corresponde a 1 micrón. Los experimentos de microscopía y transferencia Western en los paneles B y C se repitieron cada uno tres veces con resultados muy similares. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La estructura cristalina de rayos X de ComEAG reveló no solo la estructura del OD, sino también la forma tridimensional del dominio de unión al ADN de ComEA. Como se predijo a partir del análisis de secuencias y se señaló anteriormente6, la estructura del dominio de unión al ADN de ComEA contiene dos motivos hélice-horquilla-hélice (HhH) (Figs. 1B y 7A). Las estructuras de las proteínas canónicas que contienen HhH mostraron que los pares de motivos HhH generalmente están conectados por una hélice α, y estas cinco hélices juntas se denominan dominios (HhH)219. Esta hélice enlazadora que conecta los motivos HhH brilla por su ausencia en ComEA y, en cambio, sus dos motivos HhH están conectados por un bucle (Fig. 7B). El dominio de unión al ADN de ComEA es, por lo tanto, un dominio HhH atípico que forma un núcleo de unión al ADN bien plegado y compacto sin el uso de una hélice conectora.

A Alineaciones de los motivos HhH de las proteínas ComEA expresadas por cuatro bacterias grampositivas (arriba) y gramnegativas (abajo) que se han utilizado para estudios de transformación. Los cuatro residuos de lisina elegidos para la mutagénesis están resaltados en rojo. Las asignaciones de estructuras secundarias se derivaron de la estructura cristalina de los ComEAG. B Modelo del dominio de unión a ADN de ComEAG (hélices α representadas como cilindros) en complejo con dsDNA (representado como barras). El lazo que conecta HhH1 y HhH2 es de color verde. Los enlaces de hidrógeno se representan como líneas discontinuas negras. Para mayor claridad, los ComEAG se representan en un complejo con 8 pb en el centro del complejo en lugar de los 15 pb utilizados en el refinamiento. C Frecuencias de transformación para los mutantes del motivo HhH. Los experimentos de transformación se realizaron como triplicados biológicos y las frecuencias medias, los valores normalizados al tipo salvaje (BD9007) se trazan como gráficos de barras con los puntos de datos incluidos. Los valores medios normalizados con desviaciones estándar para los mutantes fueron 0,0054 ± 0,004 (K164A), 0,23 ± 0,066 (K193A), 0,54 ± 0,22 (K197A), 0,0031 ± 0,0025 (K199A). Los valores de p se determinaron mediante pruebas t bilaterales. D muestra transferencias de Western para las proteínas ComEA de tipo salvaje y mutantes obtenidas usando anticuerpos anti-GFP. Este experimento de transferencia Western se repitió un total de tres veces con resultados casi idénticos. E Análisis de EMSA de ComEAG de tipo salvaje, ComEA-K166A y ComEA-K201A. El análisis EMSA se repitió al menos dos veces con resultados casi idénticos. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para explorar la interacción ComEA-DNA, usamos Dali20 y HADDOCK 2.421 para generar un modelo ComEAGs-DNA (Fig. 7B). Además de los numerosos enlaces de hidrógeno entre los nitrógenos del esqueleto de la proteína y los grupos fosfato del ADN, que es típicamente la forma en que los dominios HhH interactúan con el ADN19,22, observamos que las cadenas laterales de Lys166, Lys195 y Thr196 formaron enlaces de hidrógeno con los grupos fosfato del ADN. Para comenzar a comprender la importancia de las interacciones de la cadena lateral de ComEA para la unión al ADN y la función de ComEA, mutamos algunos de los residuos interfaciales correspondientes en ComEAB (p. ej., ComEAB K164 y K193) a alanina y probamos su efecto sobre la transformación en B. subtilis (Fig. 7C). Además, en ausencia de una estructura ComEA-DNA determinada experimentalmente, consideramos la posibilidad de que el modelo in silico estuviera incompleto. Por ejemplo, el modelo ComEA-DNA no muestra las posibles interacciones entre los dominios de unión al ADN de ComEA que podrían ocurrir cuando los oligómeros de ComEA se unen al ADN. Por lo tanto, mutamos residuos ComEAB adicionales K197 y K199 (equivalentes a los residuos ComEAG K199 y K201) a alanina y probamos sus efectos sobre la transformación en B. subtilis.

Los mutantes de ComEAB K164A, K193A, K197A y K199A se expresaron individualmente a partir del cromosoma en B. subtilis y sus efectos sobre la transformación se compararon con los de ComEA de tipo salvaje (Fig. 7C). El análisis de transferencia Western mostró que los ComEAB de tipo salvaje y las proteínas ComEAB que contenían mutaciones en los motivos HhH se expresaron en niveles similares (Fig. 7D). Estos estudios in vivo también mostraron que las mutaciones K164A y K199A causaron una disminución de más de 2 log en la transformación (Fig. 7C), en contraste con los efectos reproducibles de 2 a 4 veces de K193A y K197A.

En el modelo ComEAGs-DNA, el residuo K166 (equivalente a ComEABs K164) entra en contacto con el ADN. De acuerdo con esta observación y la pérdida de función de ComEABs-K164 para la transformación in vivo (Fig. 7C), ComEAGs-K166A purificado (Fig. S4) no se une al ADN según lo determinado mediante un ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) (Fig. .7E). Por el contrario, en el modelo ComEAGs-DNA, el residuo K201 (equivalente a ComEABs K199) no entra en contacto con el ADN (Fig. 7B). ComEABs-K199A, sin embargo, muestra una pérdida de función in vivo (Fig. 7C), y el ComEAGs-K201A equivalente purificado (Fig. S4) mostró solo una disminución de aproximadamente 2 veces en la afinidad aparente de unión al ADN in vitro (Fig. .7E). Sospechamos que el residuo K201 de ComEAG (residuo K199 de ComEAB) puede mediar en las interacciones entre las moléculas de ComEA cuando se unen al ADN o participan en interacciones de unión al ADN que no son evidentes en el modelo ComEAGs-DNA.

Si bien se requerirán estudios estructurales adicionales para desarrollar los detalles de las interacciones intermoleculares ComEA-ComEA y ComEA-DNA dentro de un complejo ComEA-DNA, ComEABs K164 parece desempeñar un papel central. Entre todos los residuos evaluados en nuestros estudios, ComEABs K164 es el mejor conservado tanto en los grampositivos como en los gramnegativos (Fig. 7A y S2). De hecho, está al menos tan bien conservado en ComEA como los residuos característicos del motivo HhH. El laboratorio de Blokesch demostró que el residuo equivalente de V. cholerae, K63, desempeña un papel importante en ese organismo, y el modelo in silico sugirió que puede ponerse en contacto con DNA6, como parece hacer en nuestro estudio (Fig. 7B).

Además de identificar residuos importantes para la unión al ADN, los EMSA con ComEAG de tipo salvaje y con la proteína mutante K201A (Fig. 7E) exhiben evidencia de cooperatividad, consistente con las interacciones OD-OD entre moléculas ComEA unidas al ADN. A concentraciones intermedias de moléculas de proteína, el ADN totalmente desplazado coexiste con una sonda no desplazada y parcialmente desplazada. Se informó una distribución bimodal similar en los experimentos de EMSA para SSB, otra proteína de unión a ADN no específica con un comportamiento de unión cooperativo documentado23.

Este estudio presenta varios hallazgos notables. Primero, hemos demostrado la existencia de un dominio de multimerización en ComEA de B. subtilis y G. stearothermophilus, también evidente en otras proteínas ComEA multidominio codificadas por Gram-positivos (Figs. S2 y 8A). Nuestros resultados de AUC confirman que la interfaz de oligomerización deducida de la estructura cristalina es importante para la dimerización de ComEA y la existencia de estructuras de anillo en cristales de ComEAB y ComEAG, así como un experimento SV-AUC con el OD aislado, muestra que ComEA puede formar multímeros extendidos in vivo (Fig. 3A–D, Fig. 4B). Según lo determinado por MW-AUC, el tipo salvaje y ComEA-A108Y forman complejos de ADN con diferentes proporciones molares porque la unión del ADN favorece la oligomerización de ComEA al acercar las moléculas de proteína, proporcionando así un efecto cooperativo. Los resultados de EMSA que se muestran en la Fig. 6E brindan un fuerte apoyo adicional para la unión cooperativa al ADN. Si bien es tentador especular que la multimerización de ComEA in vivo genera anillos como los observados en las estructuras cristalinas, no hay evidencia de esto.

Finalmente, hemos demostrado que tanto la oligomerización como los motivos HhH de unión al ADN son necesarios para la captación de ADN en el periplasma (Figs. 6 y 7). Hemos demostrado anteriormente que ComEA juega un papel importante en B. subtilis4,18. Aunque la unión inicial de tDNA a la célula transformable tiene lugar en un tpilus expuesto a la superficie, esta unión es lábil. Cuando un bucle de tDNA se introduce en el periplasma, presumiblemente por el desmontaje del filamento tpilus9, la asociación de tDNA con la célula se vuelve estable, ya que ComEA media la captación de ADN en el periplasma18. En Neisseria gonorrheae y V. cholerae, el papel equivalente de ComEA en la captación se ha atribuido de manera convincente a un mecanismo de trinquete browniano5,6,11,12,24, en el que la unión al ADN impide la difusión retrógrada. Ahora hemos demostrado que aunque la actividad de unión al ADN de ComEA es realmente necesaria para la transformación, consistente con un simple trinquete, también lo es la oligomerización, lo que sugiere un proceso más complejo que solo la rectificación de la difusión. Una posibilidad atractiva y comprobable es que la interacción simultánea de las moléculas de ComEA entre sí y con el ADNt provoque la condensación de los complejos ADN-proteína, proporcionando una fuerza impulsora para la captación (Fig. 8B). Esto se asemejaría a las condensaciones reportadas recientemente para las interacciones del ADN con el factor de transcripción FoxA1 y con la proteína FUS25,26, las cuales se unen al ADN y exhiben autointeracción.

Un ComEAB contiene una región transmembrana N-terminal, una OD previamente no identificada y un dominio de unión a ADN C-terminal. B Hemos demostrado que ComEA se autoasocia utilizando contactos en sus OD. Después de la retracción del tpilus para llevar un bucle de ADN al periplasma, la unión del ADNt a los dominios de unión al ADN de ComEA seguido de la captación estabiliza la asociación celular, mientras que el entrecruzamiento de los segmentos de ADN distal al unirse a moléculas ComEA adyacentes condensa el ADNt entrante. , ejerciendo una fuerza de tracción para llevar el tDNA al periplasma. Los elementos de la figura fueron creados con BioRender.com.

La consideración de la condensación ComEA-tDNA como una máquina generadora de fuerza debe considerar la geometría de ComEA dentro del periplasma. Los dominios de unión y oligomerización del ADN están conectados por conectores flexibles de 20 a 25 residuos y el OD está separado de la superficie de la membrana periplásmica por otro conector de aproximadamente 60 residuos (Fig. 8A). Por lo tanto, existen considerables grados de libertad para los dos dominios dentro del periplasma. Esta movilidad puede ser un componente importante del mecanismo de condensación propuesto, permitiendo que las moléculas de ComEA adyacentes entren en contacto entre sí a través de sus OD mientras contactan diferentes segmentos de tDNA a través de sus dominios de unión al ADN, lo que efectivamente entrecruza y condensa el tDNA (Fig. 8B). ). Por lo tanto, proponemos que ComEA en bacterias Gram-positivas puede no ser simplemente un trinquete browniano, sino que puede funcionar como una proteína generadora de fuerza para la captación de tDNA.

Una comparación de las moléculas ComEA grampositivas y gramnegativas plantea dos preguntas: ¿por qué ComEAB ha evolucionado como una proteína de membrana mientras que sus ortólogos de un solo dominio pueden difundirse libremente en el periplasma y por qué solo las proteínas ComEA grampositivas contienen ¿un movimiento de cabeza? La primera pregunta puede responderse por la ausencia de una membrana externa en Gram-positivos. El anclaje de la membrana evitará la difusión y pérdida de pequeñas proteínas a través de la pared celular. De hecho, algunas proteínas de unión a ligandos, por ejemplo, aquellas que unen aminoácidos para la absorción, son difusibles en el periplasma de las bacterias Gram-negativas, pero están ancladas a la membrana en las Gram-positivas27,28,29. La presencia de una DO solo en los grampositivos también puede reflejar una diferencia en la estructura de la superficie en comparación con los gramnegativos. En las bacterias Gram-negativas, la difusión del ADN transformante a través de la pared celular característicamente delgada puede ser lo suficientemente rápida como para que un trinquete browniano efectúe una entrada eficiente al periplasma. Pero los contactos del ADN transformante con el canal necesario en el peptidoglicano grueso de los grampositivos pueden proporcionar un impedimento por fricción para la difusión, lo que requiere una fuerza de tracción adicional. Este concepto intuitivo está respaldado por un estudio que muestra que la tasa de difusión a través de un canal se reduce a medida que el canal se hace más largo30.

comEA (codones 58–205) se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de la cepa 168 de B. subtilis usando ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England Biolabs) y cebadores His6-BsuF y His6-BsuR (Tabla S2). El inserto amplificado se clonó en los sitios de restricción NcoI y XhoI de pET28b con una etiqueta His6 en su extremo C-terminal, generando el vector de expresión pComEABs. E. coli BL21(D3E) transformada con pComEABs se cultivó a 37 °C en medio LB hasta una DO de 0,6 en presencia de 30 μg/ml de kanamicina con agitación constante a 200 rpm. A continuación, se indujo la expresión de ComEAB con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,5 mM y se cultivó durante la noche a 18 °C. A continuación, las células se sedimentaron y se resuspendieron en tampón de lisis A (Tris HCl 30 mM [pH 8,0], NaCl 150 mM, glicerol al 10 %) suplementado con 20 µg/ml de ADNasa. Las células resuspendidas se lisaron usando una prensa francesa y el lisado se aclaró mediante centrifugación a 61 000 xg durante 1 hora a 4 °C. El lisado clarificado se cargó en resina His-60 (Takara) equilibrada con tampón B (Tris HCl 30 mM [pH 8,0], NaCl 150 mM, imidazol 20 mM). La resina se lavó con tampón C (Tris HCl 30 mM [pH 8,0], NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) y luego con tampón B. Para eliminar el ADN residual, la resina se incubó con tampón D (Tris HCl 30 mM [pH 8.0], NaCl 150 mM, imidazol 10 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM y DNasa 20 μg/ml) a temperatura ambiente durante 30 min. La resina se lavó con tampón B y la proteína se eluyó con tampón B que contenía imidazol 500 mM. La pureza de la proteína se analizó utilizando SDS-PAGE. Las fracciones que contenían ComEAB se dializaron durante la noche contra el tampón E (Tris HCl 30 mM [pH 8,0], NaCl 50 mM) y se cargaron en una columna Source 15Q equilibrada con el tampón E. La proteína se eluyó usando un gradiente lineal de tampón E y tampón F ( Tris HCl 30 mM [pH 8,0], NaCl 1 M) en 20 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían ComEAB purificados se agruparon y concentraron utilizando un dispositivo concentrador centrífugo MWCO de 3 kDa. La proteína concentrada se cargó en una columna de filtración de gel Superdex200 10/300 (GE Healthcare), que se equilibró con tampón G (citrato 15 mM [pH 4,5], NaCl 100 mM). La proteína eluida se concentró utilizando un dispositivo de filtro centrífugo MWCO de 3 kDa y se almacenó a -80 °C.

Se sintetizó comEA (codones 58–205) (codón optimizado para la expresión en E. coli (Genscript, Inc.)) y se clonó en pET28b para producir pComEABs-A101M, T126M que contenía una etiqueta His6 C-terminal y mutaciones A101M y T126M. Se hizo crecer un cultivo primario durante la noche en 1X LB durante la noche a 37 °C en presencia de kanamicina 30 μg/ml, agitado a 200 rpm. Las células se recogieron por centrifugación a 4500 xg durante 15 min. El sedimento celular se lavó dos veces con medio base SeMET (SelenoMethionine Medium Base Plus Nutrient Mix - Molecular Dimensions), y finalmente se resuspendió en 10 ml de medio SeMet que contenía 50 mg/L de selenometionina y se inoculó un medio de cultivo SeMet secundario. Este cultivo se hizo crecer a 37 °C hasta una DO de 0,6, después de lo cual se añadió IPTG 0,5 mM para inducir la expresión de ComEAB. Las células se cultivaron durante 16 h adicionales a 18 °C y luego se sedimentaron mediante centrifugación a 4500 xg durante 15 min. A continuación, los ComEAB derivados de selenometionina se purificaron utilizando el mismo protocolo que se describe para los ComEAB nativos.

comEAGs (codones 60–207) se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de Geobacillus stearothermophilus (ATCC 7953) usando Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) con los cebadores His-Sumo-Gsth_F y His-Sumo-Gsth_R (Tabla S2) . Se usó el método Gibson Assembly (New England Biolabs) para clonar el producto de PCR amplificado en el vector pTB146 entre los sitios SapI y XhoI. El constructo resultante pComEAGs tenía una etiqueta His-Sumo en su extremo N-terminal. Los clones positivos se verificaron mediante secuenciación de ADN.

His-Sumo-ComEAGs se sobreexpresó en E. coli BL21 (DE3). Los cultivos se cultivaron en medio LB a 37 °C en presencia de 100 μg/ml de ampicilina hasta una DO600 de 0,6. Se indujo la expresión de His-Sumo-ComEAGs mediante la adición de IPTG 0,5 mM seguido de crecimiento durante la noche a 18 °C. A continuación, las células se sedimentaron y se resuspendieron en tampón de lisis A (Tris HCl 30 mM [pH 8,0], NaCl 150 mM, glicerol al 10%) suplementado con 20 µg/ml de ADNasa (Goldbio). Las células resuspendidas se lisaron en una prensa francesa y el lisado se aclaró mediante centrifugación a 61 000 xg durante 1 hora a 4 °C. El lisado clarificado se cargó en resina His-60 (Takara) equilibrada con tampón B (Tris HCl 30 mM [pH 8,0], NaCl 150 mM, imidazol 20 mM). La resina se lavó con tampón C (Tris HCl 30 mM [pH 8,0], NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) y luego con tampón B. Para eliminar el ADN residual, la resina se incubó con tampón D (Tris HCl 30 mM [pH 8.0], NaCl 150 mM, imidazol 10 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM y DNasa 20 μg/ml) a 23 °C durante 30 min. La resina se lavó con tampón B y la proteína se eluyó con tampón B que contenía imidazol 500 mM. La pureza de la proteína se analizó utilizando SDS-PAGE. A continuación, se eliminó la etiqueta His-Sumo mediante la adición de 1,5 mg/ml de His-Ulp1 a los ComEAG seguido de diálisis frente al tampón E (Tris HCl 30 mM [pH 8,0], NaCl 50 mM) durante la noche a 4 °C. El His-Sumo y el His-Ulp1 escindidos se eliminaron pasando la muestra sobre resina His-60 Ni fresca (Takara). Los ComEAG escindidos sin una etiqueta His-Sumo se agruparon y se cargaron en una columna Source 15Q equilibrada con tampón E (Tris HCl 30 mM [pH 8,0], NaCl 50 mM). La proteína se eluyó utilizando un gradiente lineal de tampón E y tampón F (Tris HCl 30 mM [pH 8,0], NaCl 1000 mM) en 20 volúmenes de columna. Los ComEAG obtenidos después de Source 15Q todavía contenían impurezas, que se eliminaron utilizando una columna Hitrap Heparin HP de 5 ml (Cytiva), que se había equilibrado con tampón E (Tris HCl 30 mM [pH 8,0], NaCl 50 mM). La proteína se eluyó con un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna de tampón E y tampón F (Tris HCl 30 mM [pH 8,0], NaCl 1 M). Las fracciones que contenían ComEA puro se agruparon y luego se concentraron en un dispositivo de filtro centrífugo MWCO de 3 kDa. La proteína concentrada se purificó adicionalmente mediante cromatografía de filtración en gel utilizando una columna Superdex200 10/300 (GE Healthcare), que se había equilibrado con tampón G (Tris 10 mM [pH 8], KCl 100 mM). Luego, los ComEAG se concentraron utilizando un dispositivo de filtro centrífugo MWCO de 3 kDa y se almacenaron a -80 ° C.

comEAGs-OD (codones 60–122) se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de Geobacillus stearothermophilus (ATCC 7953) usando Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) con los cebadores His-Sumo-Gsth_F y His-Sumo-OD_R (Tabla S2). Se usó el método Gibson Assembly (New England Biolabs) para clonar el producto de PCR amplificado en el vector pTB146 entre los sitios SapI y XhoI. La construcción resultante pComEAGs-OD tenía una etiqueta His-Sumo en su extremo N-terminal. Los clones positivos se verificaron mediante secuenciación de ADN. ComEAGs-OD se purificó usando el mismo protocolo descrito para ComEAGs de tipo salvaje.

ComEAGs-A108Y, ComEAGs-K166A y ComEAGs-K201A se generaron utilizando un kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (New England Biolabs) con oligonucleótidos mutagénicos descritos en la Tabla S2. Los clones positivos se confirmaron mediante secuenciación de ADN. ComEAGs-A108Y, ComEAGs-K166A y ComEAGs-K201A se purificaron utilizando el mismo protocolo descrito para ComEAG de tipo salvaje. Las proteínas ComEA mutantes y de tipo salvaje exhibieron solubilidades idénticas y se comportaron de manera similar durante la purificación (Fig. S4). En consonancia con su incapacidad para dimerizarse, la mutación A108Y provocó que los ComEAG eluyeran 0,40 ml más tarde que los ComEAG de tipo salvaje en la columna Superdex200 10/300 (GE Healthcare) equilibrada con tampón G (Tris 10 mM [pH 8], KCl 100 mM) como se describió anteriormente.

Los cristales de ComEABs-A101M,T126M y ComEABs aparecieron en dos o tres días, maduraron en una semana y se obtuvieron mediante el método de difusión de vapor mezclando 1 μl de ComEABs (10 mg/ml) con un volumen igual de madre. solución de licor que contiene 22 % de PEG 500 y succinato 0,1 M [pH 5,5] a 20 °C. A continuación, los cristales se crioprotegieron utilizando la misma solución de licor madre suplementada con glicerol al 10%.

Los datos de rayos X se recopilaron utilizando Blu-Ice 5 en la línea de luz 14–1 de Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (SSRL) a temperatura criogénica utilizando un detector CCD MAR mosaic 325. Los datos de difracción de los cristales de ComEABs-A101M, T126M y ComEABs se recopilaron a 0,97900 Å y 0,97946 Å, respectivamente. Los datos fueron procesados utilizando el paquete de software HKL31. Se utilizó Autosol32 para localizar la posición de los átomos de ComEABs-A101M,T126M Se (cifra de mérito = 0,36) y se construyó un modelo inicial. Este modelo se usó para obtener fases para la estructura nativa de ComEABs usando reemplazo molecular en Phaser33. Posteriormente, el modelo se construyó manualmente en COOT34 y se refinó con los datos de difracción nativos usando phenix.refine35. Las rondas iniciales de refinamiento incluyeron recocido simulado, coordenadas atómicas individuales y refinamiento del factor B. Las rondas posteriores de refinamiento emplearon coordenadas atómicas individuales, factor B individual y refinamiento TLS. El modelo final contenía la densidad electrónica de los residuos 59- o 60-122. No observamos la densidad de electrones correspondiente al inicio de ingeniería Met; o ComEA residuos 58, 59 (de la cadena G), 123-205; o la etiqueta C-terminal His diseñada. Las estadísticas de Ramachandran para ComEAB fueron 95,84 % favorecidas, 4,16 % favorecidas y 0,00 % de valores atípicos y se calcularon utilizando Molprobity36. La visualización de la estructura y los gráficos moleculares se generaron en PyMOL37.

Los cristales de ComEAG generalmente aparecían dentro de 2 a 3 días, crecían hasta la madurez en una semana y se obtenían mediante el método de difusión de vapor de gota sentada a 20 °C. Se mezcló ComEAG a 10 mg/ml con un volumen igual de licor madre que contenía PEG 400 al 30% y nitrato de amonio 0,1 M. Los datos de rayos X se recopilaron internamente utilizando StructureStudio 2.4.6 y un generador de rayos X de ánodo de cobre giratorio Rigaku Micro/Max-007HF con un detector Rigaku RAXIS-IV ++ a temperatura ambiente. Los datos de difracción de los cristales de ComEAG se recogieron a 1,5418 Å. Los datos fueron procesados utilizando el paquete de software HKL31. Las fases iniciales se obtuvieron por reemplazo molecular en Phaser33 utilizando la estructura parcial de ComEABs como modelo de búsqueda. El modelo ComEAGs se creó en COOT34 y se refinó con phenix.refine35. Las rondas iniciales de refinamiento incluyeron recocido simulado, coordenadas atómicas individuales y refinamiento del factor B. Las rondas posteriores de refinamiento emplearon coordenadas atómicas individuales, factor B individual y refinamiento TLS. El modelo final contenía la densidad electrónica de los residuos 62–124 (en las cadenas A y B) y 143–207 (en la cadena A). No observamos la densidad de electrones correspondiente al inicio de ingeniería Met; residuos 60–61, 125–142 o 143–207 (en la cadena B). Las estadísticas de Ramachandran para ComEAG fueron 96,76 % favorecidas, 2,70 % favorecidas y 0,54 % de valores atípicos y se calcularon utilizando Molbrobity36. La visualización de la estructura y los gráficos moleculares se generaron en PyMOL37.

Los experimentos de velocidad de sedimentación (SVE) miden el transporte de masa de macromoléculas en un campo de fuerza centrífuga en solución y observan las propiedades de sedimentación y difusión de todas las especies en una mezcla, e informan sus concentraciones parciales, masas molares flotantes y factores de forma. El transporte de sedimentación y difusión en la celda de ultracentrifugación se describe mediante la ecuación de Lamm, que se resuelve mediante métodos de elementos finitos adaptativos38,39. Los datos de límites completos obtenidos en los experimentos SV se ajustan mediante combinaciones lineales de tales soluciones utilizando rutinas de optimización avanzadas40,41,42 que son computacionalmente intensivas y se llevan a cabo en plataformas informáticas de alto rendimiento43. Las SVE se realizaron en un Beckman Coulter Optima AUC en el Centro Canadiense de Hidrodinámica de la Universidad de Lethbridge. Los datos se recopilaron utilizando detección UV de longitud de onda única o múltiple. Se llenaron 0,45 ml de muestra en centros de mesa de carbón epon de doble sector equipados con ventanas de zafiro y se midieron en modo de intensidad. Todos los experimentos se realizaron a 20 °C y en un tampón que contenía Tris 10 mM [pH 8], KCl 100 mM. ComEAGs-OD se midió a 37 krpm. Los ComEAG y el ADN se midieron a 60 krpm. Los datos de MW-AUC que involucran la secuencia de ADN de 14 pb se midieron a 55 krpm, mientras que los datos de MW-AUC que involucran la secuencia de ADN de 40 pb se recolectaron a 43 krpm. Los datos de MW-AUC se registraron en el rango de 235 a 285 nm con incrementos de 2 nm, proporcionando 26 conjuntos de datos individuales para cada muestra. Todos los datos se analizaron con UltraScan 4.044. El procesamiento de los datos de MW-AUC se describe detalladamente en Henrickson et al., 202214. Brevemente, los datos de cada longitud de onda se analizaron mediante el análisis de espectro bidimensional (2DSA)40, siguiendo el flujo de trabajo descrito en45. Después de generar SVE sincrónicos en el tiempo, el perfil hidrodinámico se desconvoluciona espectralmente en los perfiles de coeficiente de extinción molar de proteína y ADN. Las correcciones de densidad y viscosidad del tampón se calcularon con UltraScan usando la concentración parcial de cada componente del tampón. Los perfiles de extinción molar se determinaron realizando series de dilución separadas para cada proteína y ADN, recopilando un espectro de absorbancia en el rango espectral de interés (220–300 nm) utilizando un espectrofotómetro de sobremesa Genesys 10 s (Thermo Fisher Scientific). La serie de dilución de cada espectro de absorbancia se ajustó a un perfil de extinción intrínseco como se describió anteriormente44. Los perfiles de extinción intrínsecos resultantes se escalaron a concentración molar usando un coeficiente de extinción de 7450 M-1 cm-1 a 280 nm para ComEAGs-A108Y y 5960 M-1 cm-1 a 280 nm para ComEAG (según lo estimado por UltraScan a partir de la secuencia de proteínas). ). Se generaron perfiles de coeficiente de sedimentación corregidos por difusión utilizando el análisis van Holde – Weischet mejorado implementado en UltraScan46. Los resultados de Van Holde – Weischet se muestran como diagramas de distribución integral G(s), que muestran la concentración integrada de una especie sedimentadora en el eje y. Como se muestra en las Figs. 4 y 5, todas las concentraciones están normalizadas entre 0 y 100 % de la señal límite. Estos resultados sugieren una Kd para el equilibrio monómero-dímero entre 10 y 160 μM. Para determinar la constante de disociación para el equilibrio monómero-dímero de los ComEAG, se ajustó un experimento de velocidad de sedimentación de una concentración de carga intermedia (31,3 μM, medida a 280 nm) a un modelo discreto de monómero-dímero utilizando un algoritmo genético Análisis de Monte Carlo como se describe en 13 y 42. Los resultados de ajuste detallados se muestran en la Tabla S4.

Todas las cepas de B. subtilis se derivaron finalmente de la cepa de laboratorio 168. La cepa original inmediata en todos los casos fue IS75 (his leu met). Todas las cepas se construyeron por transformación y se enumeran en la Tabla S3. Las cepas están disponibles a pedido de los autores.

Se cortó un plásmido de E. coli (pED2232), descrito en 18, con EcoRI para liberar un fragmento de 3045 pb que portaba una construcción YFP-comEA. Este fragmento se aisló y clonó en pDR1664, (un plásmido de inserción en el locus thr obtenido como obsequio de David Rudner), cortado con EcoRI. El fragmento contenía 1.500 pb aguas arriba de la secuencia codificante de comEA que incluye el promotor, el sitio de unión al ribosoma y el codón de inicio de comEA. El resto del fragmento contiene el gen YFP fusionado con el extremo N del marco de lectura abierto de comEA. El plásmido resultante, pED2401, se linealizó con PvuI y se transformó en IS75 donde se inserta en el locus thr. A continuación, se eliminó el marco de lectura abierto de comEA nativo mediante la inserción de una cepa BD9007 productora de casete de resistencia a la kanamicina.

Las mutaciones en ComEA se construyeron utilizando el plásmido pED2401 y un kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (New England Biolabs). Los oligonucleótidos mutagénicos se enumeran en la Tabla S2. Después de la verificación secuenciando todo el marco de lectura de comEA, los plásmidos correctos se linealizaron con PvuI y se transformaron en BD5810 para su inserción en thr. Finalmente, el marco de lectura nativo de comEA se inactivó como se describe anteriormente.

Se marcaron 0,5 μg de ADN del bacteriófago Lambda (New England Biolabs) con el reactivo de rodamina TM Mirus Label-IT (Mirus Bio) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, con la excepción de que se usó cuatro veces menos reactivo de marcaje. Luego, el ADN se procesó a través de una columna G50 MicroSpin (GE Healthcare) para eliminar el exceso de etiqueta.

La transferencia Western se llevó a cabo utilizando métodos estándar con transferencia semiseca, y las transferencias de nitrocelulosa se revelaron utilizando sustrato Clarity Max Western ECL (Bio-Rad). Las imágenes se registraron con un reproductor de imágenes Bio-Rad ChemiDoc MP. Se utilizó una dilución 1:1000 de Anticuerpo Anti GFP (Thermofisher) para revelar las señales de YFP-ComEA. Los cultivos para la preparación de extractos se hicieron crecer hasta la competencia y se controló el crecimiento en un colorímetro Klett. Después de la recolección por centrifugación, las células se resuspendieron en volúmenes ligeramente diferentes para compensar las diferencias menores en la turbidez, asegurando que se cargara proteína total equivalente en cada carril. Debido a que todas las cepas portaban un gen ectópico que codificaba YFP no fusionado, estaba presente un control de carga interno en cada carril.

Todas las cepas de Bacillus subtilis se cultivaron hasta la competencia usando el método de 2 pasos y se transformaron como se describió anteriormente47. Las frecuencias de transformación se determinaron seleccionando prototrofia de leucina, utilizando triplicados biológicos.

Se añadieron 0,2 µg/ml de ADN de bacteriófago lambda marcado con rodamina a cultivos competentes y se incubaron durante 45 min. Las muestras de 100 μl se lavaron 2 veces con sales de Spizizen y se resuspendieron en 100 μl de solución de sales de Spizizen48. Se montó 1 μl de las células transformadas en una fina almohadilla de agarosa para microscopía.

Las imágenes se adquirieron con el software Nikon Elements y un microscopio Nikon Ti, equipado con un objetivo de inmersión en aceite Plan Apo de 100×, NA 1.40, fuentes de excitación de diodos emisores de luz (LED) y una cámara Orca Flash 4.0 (Hamamatsu). Se utilizó Nikon Elements para la adquisición de datos y el análisis de imágenes.

El servidor Dali20 identificó la estructura unida al ADN de XPF (PDB ID 2BGW)49 como similar al dominio de unión al ADN de ComEAG (residuos 143–207). El dominio de unión a ADN de ComEAG se alineó con XPF para generar el modelo inicial del dominio de unión a ADN de ComEAG en complejo con 15 pb de ADN. Este modelo se refinó en HADDOCK 2.4 usando el refinamiento flexible en el enfoque de solvente explícito21.

Los ensayos de cambio de movilidad electroforética se realizaron como se describió anteriormente con una ligera modificación6. Brevemente, los ComEAG a las concentraciones indicadas y ADN de 30 pb 0,5 μM se mezclaron en tampón que contenía Tris 10 mM [pH 8], KCl 100 mM, glicerol al 2,5 %, ácido etilendiaminotetraacético 0,5 mM y MgCl2 1 mM a temperatura ambiente durante 15 min. Posteriormente, se añadieron a las muestras 0,5 volúmenes de colorante de carga que contenía azul de bromofenol y 2,5% de glicerol. A continuación, las muestras se cargaron inmediatamente en un gel de poliacrilamida nativa al 8 % antes de ejecutarse a 4 °C en tampón TBE 0,5X. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se escanearon utilizando un generador de imágenes Bio-Rad ChemiDoc MP.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas y los factores de estructura para ComEAB y ComEAG se han depositado en Protein Data Bank con los códigos de acceso 8DFK y 8DSS, respectivamente. Los datos de origen se proporcionan con este documento. Todos los datos AUC (datos de velocidad de sedimentación primaria, resultados del modelo ajustado e informes) se almacenan en la base de datos UltraScan LIMS en el Centro Canadiense de Hidrodinámica. Los datos se pueden compartir a pedido en el formato OpenAUC de código abierto compatible con UltraScan (Cölfen H, Laue TM, Wohlleben W, Schilling K, Karabudak E, Langhorst BW, Brookes E, Dubbs B, Zollars D, Rocco M, Demeler B. The Open AUC Project. Eur Biophys J. 2010 Feb;39(3):347-59. https://doi.org/10.1007/s00249-009-0438-9. Epub 2009 Mar 19. PMID: 19296095; PMCID: PMC2812709 ., https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19296095/). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Dubnau, D. & Blokesch, M. Mecanismos de captación de ADN por bacterias naturalmente competentes. Annu Rev. Genet 53, 217–237 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Johnston, C., Martin, B., Fichant, G., Polard, P. & Claverys, JP Transformación bacteriana: distribución, mecanismos compartidos y control divergente. Nat. Rev. Microbiol 12, 181–196 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Provvedi, R. & Dubnau, D. ComEA es un receptor de ADN para la transformación de Bacillus subtilis competente. mol. Microbiol 31, 271–280 (1999).

Artículo CAS Google Académico

Inamine, GS & Dubnau, D. ComEA, una proteína de membrana integral de Bacillus subtilis requerida para la transformación genética, es necesaria tanto para la unión como para el transporte del ADN. J. Bacteriol. 177, 3045–3051 (1995).

Artículo CAS Google Académico

Gangel, H. et al. Dinámica espacio-temporal concertada de ADN importado y proteína de captación de ADN ComE durante la transformación gonocócica. Patog de PLoS. 10, e1004043 (2014).

Artículo Google Académico

Seitz, P. et al. ComEA es esencial para la transferencia de ADN externo al periplasma en células de Vibrio cholerae transformables de forma natural. PLoS Genet 10, e1004066 (2014).

Artículo Google Académico

Seitz, P. & Blokesch, M. El transporte de ADN a través de las membranas externa e interna de Vibrio cholerae naturalmente transformable está acoplado espacial pero no temporalmente. mBio 5, https://doi.org/10.1128/mBio.01409-14 (2014).

Stingl, K., Muller, S., Scheidgen-Kleyboldt, G., Clausen, M. y Maier, B. El sistema compuesto media la captación de ADN en dos pasos en Helicobacter pylori. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 107, 1184–1189 (2010).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Ellison, CK et al. La retracción de los pili de competencia de tipo IV unidos al ADN inicia la captación de ADN durante la transformación natural en Vibrio cholerae. Nat. Microbiol 3, 773–780 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Lam, T. et al. Los pili de competencia en Streptococcus pneumoniae son estructuras altamente dinámicas que se retraen para promover la captación de ADN. mol. Microbiol 116, 381–396 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Hepp, C. & Maier, B. La cinética de la captación de ADN durante la transformación proporciona evidencia de un mecanismo de trinquete de translocación. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 113, 12467–12472 (2016).

Artículo ADS CAS Google Académico

Peskin, CS, Odell, GM & Oster, GF Movimientos celulares y fluctuaciones térmicas: el trinquete browniano. Biografía. J. 65, 316–324 (1993).

Artículo ADS CAS Google Académico

Demeler, B., Brookes, E., Wang, R., Schirf, V. y Kim, CA Caracterización de asociaciones reversibles por velocidad de sedimentación con UltraScan. macromol. Biosci. 10, 775–782 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Henrickson, A. et al. Ultracentrifugación analítica multilongitud de onda de mezclas e interacciones de biopolímeros. Anal. Bioquímica 652, 114728 (2022).

Artículo CAS Google Académico

Horne, CR, Henrickson, A., Demeler, B. & Dobson, RCJ Ultracentrifugación analítica de longitud de onda múltiple como herramienta para caracterizar las interacciones proteína-ADN en solución. EUR. Biografía. J. 49, 819–827 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Demeler, B. Medición de interacciones moleculares en solución mediante ultracentrifugación analítica de longitud de onda múltiple: combinación de análisis espectral con hidrodinámica. Biochem (Londres) 41, 14–18 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Gorbet, GE, Pearson, JZ, Demeler, AK, Colfen, H. y Demeler, B. AUC de próxima generación: análisis de datos de ultracentrifugación analítica de longitud de onda múltiple. Métodos Enzymol. 562, 27–47 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Hahn, J., DeSantis, M. y Dubnau, D. Mecanismos de transformación de la captación de ADN en el periplasma de Bacillus subtilis. mBio 12, e0106121 (2021).

Artículo Google Académico

Shao, X. & Grishin, NV Pliegue común en proteínas hélice-horquilla-hélice. Ácidos nucleicos Res 28, 2643–2650 (2000).

Artículo CAS Google Académico

Holm, L. Uso de Dali para la comparación de la estructura de proteínas. Métodos Mol. Biol. 2112, 29–42 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Honorato, RV et al. Biología estructural en las nubes: el ecosistema WeNMR-EOSC. Frente Mol. Biosci. 8, 729513 (2021).

Artículo Google Académico

Doherty, AJ, Serpell, LC y Ponting, CP El motivo de unión al ADN hélice-horquilla-hélice: una base estructural para el reconocimiento de ADN no específico de secuencia. Ácidos Nucleicos Res. 24, 2488–2497 (1996).

Artículo CAS Google Académico

Dubiel, K. et al. Mecanismos estructurales de unión cooperativa de ADN por proteínas bacterianas de unión a ADN monocatenario. J. Mol. Biol. 431, 178–195 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Hepp, C. & Maier, B. Trinquetes de translocación bacteriana: principios físicos compartidos con diferentes implementaciones moleculares: cómo los sistemas de secreción bacteriana sesgan el movimiento browniano para una translocación eficiente de macromoléculas. Bioensayos 39, https://doi.org/10.1002/bies.201700099 (2017).

Renger, R. et al. Co-condensación de proteínas con ADN monocatenario y bicatenario. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 119, e2107871119 (2022).

Artículo CAS Google Académico

Codorniz, T. et al. Generación de fuerza por co-condensación proteína-ADN. Nat. física 17, 1007–1012 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Hediger, MA Estructura, función y evolución de los transportadores de solutos en procariotas y eucariotas. Exp. J. Biol. 196, 15–49 (1994).

Artículo CAS Google Académico

Saurin, W. & Dassa, E. Relaciones de secuencia entre proteínas integrales de la membrana interna de los sistemas de transporte dependientes de proteínas de unión: evolución por duplicaciones de genes recurrentes. Ciencia de las proteínas 3, 325–344 (1994).

Artículo CAS Google Académico

Tam, R. & Saier, MH Jr. Relaciones estructurales, funcionales y evolutivas entre los receptores de bacterias que se unen a solutos extracelulares. Microbiol Rev. 57, 320–346 (1993).

Artículo CAS Google Académico

Tottori, S., Misiunas, K., Tshitoyan, V. & Keyser, UF Dependencia de la longitud del canal de la difusividad de partículas en confinamiento. Materia blanda 17, 5131–5136 (2021).

Artículo ADS CAS Google Académico

Otwinowski, Z. & Minor, W. [20] Procesamiento de datos de difracción de rayos X recopilados en modo de oscilación. Métodos Enzymol. 276, 307–326 (1997).

Artículo CAS Google Académico

Terwilliger, TC et al. Toma de decisiones en solución de estructura utilizando estimaciones bayesianas de calidad de mapa: el asistente PHENIX AutoSol. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 65, 582–601 (2009).

Artículo CAS Google Académico

McCoy, AJ et al. Software cristalográfico Phaser. J. Appl Crystallogr 40, 658–674 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: herramientas de construcción de modelos para gráficos moleculares. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 60, 2126–2132 (2004).

Artículo Google Académico

Adams, PD et al. PHENIX: un sistema integral basado en Python para la solución de estructuras macromoleculares. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 66, 213–221 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Lovell, SC et al. Validación de estructuras por geometría Calpha: desviación phi,psi y Cbeta. Proteínas 50, 437–450 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Schrodinger, LLC El sistema de gráficos moleculares PyMOL, versión 2.4.

Cao, W. & Demeler, B. Modelado de experimentos analíticos de ultracentrifugación con una solución adaptativa de elementos finitos de espacio-tiempo de la ecuación de Lamm. Biografía. J. 89, 1589–1602 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Cao, W. & Demeler, B. Modelado de experimentos analíticos de ultracentrifugación con una solución de elementos finitos de espacio-tiempo adaptativa para sistemas de reacción multicomponente. Biografía. J. 95, 54–65 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Brookes, E., Cao, W. & Demeler, B. Un análisis de espectro bidimensional para experimentos de velocidad de sedimentación de mezclas con heterogeneidad en peso molecular y forma. EUR. Biografía. J. 39, 405–414 (2010).

Artículo Google Académico

Brookes, EH & Demeler, B. en GECCO07: Conferencia de Computación Genética y Evolutiva. 361-368 (Association for Computing Machinery, Nueva York, NY, Estados Unidos, 2007).

Demeler, B. & Brookes, E. Monte Carlo análisis de experimentos de sedimentación. polimero coloide ciencia 286, 129–137 (2007).

Artículo Google Académico

Brookes, E. & Demeler, B. Técnicas computacionales paralelas para el análisis de experimentos de velocidad de sedimentación en UltraScan. polimero coloide ciencia 286, 139–148 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Demeler, B. y Gorbet, GE en ultracentrifugación analítica: instrumentación, software y aplicaciones (eds Uchiyama S., Arisaka F., Stafford WF y Laue T.) 119-143 (Springer Japan, 2016).

Demeler, B. Métodos para el diseño y análisis de experimentos de velocidad de sedimentación y equilibrio de sedimentación con proteínas. actual Protocolo Ciencia de las proteínas Capítulo 7, Unidad 7 13 (2010).

Google Académico

Demeler, B. & van Holde, KE Análisis de velocidad de sedimentación de sistemas altamente heterogéneos. Anal. Biochem 335, 279–288 (2004).

Artículo CAS Google Académico

Dubnau, D. y Davidoff-Abelson, R. Destino de la transformación del ADN después de la absorción por Bacillus subtilis competente. I. Formación y propiedades del complejo donante-receptor. J. Mol. Biol. 56, 209–221 (1971).

Artículo CAS Google Académico

Spizizen, J. Transformación de cepas bioquímicamente deficientes de Bacillus Subtilis por desoxirribonucleado. proc. Academia Nacional. ciencia Estados Unidos 44, 1072–1078 (1958).

Artículo ADS CAS Google Académico

Newman, M. et al. La estructura de una endonucleasa XPF con y sin ADN sugiere un modelo para el reconocimiento de sustrato. EMBO J. 24, 895–905 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Laskowski, RA & Swindells, MB LigPlot+: múltiples diagramas de interacción ligando-proteína para el descubrimiento de fármacos. J. Chem. información Modelo 51, 2778–2786 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Descargar referencias

Los datos de difracción de rayos X se recopilaron en la fuente de luz de radiación de sincrotrón de Stanford. El uso de la fuente de luz de radiación de sincrotrón de Stanford, SLAC National Accelerator Laboratory, está respaldado por el Departamento de Energía de EE. UU., Oficina de Ciencias, Oficina de Ciencias Básicas de la Energía bajo el Contrato No. DE-AC02-76SF00515. El Programa de Biología Molecular Estructural de SSRL cuenta con el respaldo de la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental del DOE y de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (P41GM103393). El contenido de esta publicación es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de NIGMS, NIAID o NIH. El apoyo para este trabajo fue proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud Grant R01 GM057720 (MBN y DD). Los experimentos de ultracentrifugación analítica recibieron el apoyo del programa Canada 150 Research Chairs (C150-2017-00015, BD), la Canada Foundation for Innovation (CFI-37589, BD), los National Institutes of Health (1R01GM120600, BD) y el Canadian Natural Science y Consejo de Investigaciones de Ingeniería (DG-RGPIN-2019-05637, BD). Los cálculos de la supercomputadora UltraScan se respaldaron a través de la subvención TG-MCB070039N (BD) de NSF/XSEDE y la subvención TG457201 (BD) de la Universidad de Texas. El Consejo Canadiense de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería apoya a AH a través de una beca.

Departamento de Microbiología, Bioquímica y Genética Molecular, Facultad de Medicina de Nueva Jersey, Ciencias Biomédicas de la Salud de Rutgers, Newark, NJ, 07103, EE. UU.

Ishtiyaq Ahmed, David Dubnau y Matthew B. Neiditch

Instituto de Investigación de Salud Pública, Rutgers Biomedical Health Sciences, Newark, NJ, 07103, EE. UU.

Jeanette Hahn y David Dubnau

Departamento de Química y Bioquímica, Universidad de Lethbridge, Lethbridge, AB, T1K 3M4, Canadá

Amy Henrickson y Borries Demeler

Instituto de Investigación del Cáncer Infantil Greehey, Salud de la Universidad de Texas en San Antonio, San Antonio, TX, 78229, EE. UU.

Faisal Tariq Khaja

Departamento de Química y Bioquímica, Universidad de Montana, Missoula, MT, 59801, EE. UU.

Borries Demeler

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

MBN y DD concibieron el estudio, diseñaron experimentos, analizaron datos, obtuvieron fondos y escribieron el manuscrito con contribuciones de todos los autores, especialmente BD e IAIA, ComEAB y ComEAG purificados; diseñó y realizó los estudios bioquímicos y cristalográficos de rayos X de las proteínas ComEA; realizó análisis bioinformático de ComEA; datos analizados; y generó figuras y tablas. JH realizó los estudios de transformación de B. subtilis, incluidas las transferencias Western. AH y BD diseñaron y llevaron a cabo los experimentos AUC y MW-AUC y generaron figuras y tablas. FTK purificó ComEAB, identificó las condiciones de cristalización de ComEAB y recopiló datos de difracción de ComEAB nativos.

Correspondencia a David Dubnau o Matthew B. Neiditch.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Ahmed, I., Hahn, J., Henrickson, A. et al. Los estudios de estructura y función revelan que ComEA contiene un dominio de oligomerización esencial para la transformación en bacterias grampositivas. Nat Comun 13, 7724 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35129-0

Descargar cita

Recibido: 25 julio 2022

Aceptado: 18 de noviembre de 2022

Publicado: 13 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35129-0

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Revista Europea de Biofísica (2023)

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.