microARN - Grupo Co., Ltd de los laboratorios de minería de Foshan

Parásitos y vectores volumen 16, Número de artículo: 184 (2023) Citar este artículo

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La esquistosomiasis es una enfermedad parasitaria grave pero desatendida en humanos que puede provocar fibrosis hepática y la muerte. Las células estrelladas hepáticas activadas (HSC) son los principales efectores que promueven la acumulación de proteínas de la matriz extracelular (ECM) durante la fibrosis hepática. La expresión aberrante de microARN-29 está implicada en el desarrollo de enfermedades fibróticas. Sin embargo, se sabe menos sobre el papel de miR-29 en la fibrosis hepática inducida por Schistosoma japonicum (S. japonicum).

Los niveles de microARN-29a-3p (miR-29a-3p) y el homólogo 1 de Roundabout (Robo1) se examinaron en tejidos hepáticos durante la infección por S. japonicum. Se determinó la posible implicación de la vía de señalización miR-29a-3p-Robo1. Utilizamos ratones knock-in condicionales MIR29A y ratones inyectados con un agomir miR-29a-3p para investigar el papel de miR-29a-3p en la fibrosis hepática inducida por esquistosomiasis. Las contribuciones funcionales de la señalización de miR-29a-3p-Robo1 en la fibrosis hepática y la activación de HSC se investigaron utilizando HSC primarias de ratón y la línea celular de HSC humana LX-2.

MiR-29a-3p se reguló negativamente en humanos y ratones con fibrosis inducida por esquistosoma, y Robo1 se reguló positivamente en tejidos hepáticos. El miR-29a-3p apuntó a Robo1 y reguló negativamente su expresión. Además, el nivel de expresión de miR-29a-3p en pacientes con esquistosomiasis se correlacionó en gran medida con el diámetro del grosor de la vena porta y del bazo, que representan la gravedad de la fibrosis. Además, demostramos que la elevación eficiente y sostenida de miR-29a-3p revirtió la fibrosis hepática inducida por esquistosoma. En particular, mostramos que miR-29a-3p apuntó a Robo1 en HSC para prevenir la activación de HSC durante la infección.

Nuestros resultados proporcionan evidencia experimental y clínica de que la vía de señalización miR-29a-3p-Robo1 en las HSC desempeña un papel importante en el desarrollo de la fibrosis hepática. Por lo tanto, nuestro estudio destaca el potencial de miR-29a-3p como intervención terapéutica para la esquistosomiasis y otras enfermedades fibróticas.

La esquistosomiasis es una de las enfermedades infecciosas tropicales más prevalentes, pero desatendida, y afecta a más de 230 millones de personas en 78 países, incluidos niños y adultos jóvenes [1]. Las dos especies más importantes que causan enfermedades hepáticas en humanos son Schistosoma mansoni y Schistosoma japonicum (S. japonicum) [2]. La patología principal de la esquistosomiasis inducida por S. japonicum es la formación de granulomas y fibrosis inducidas por huevos. Las hembras adultas que viven en las venas mesentéricas del huésped ponen numerosos huevos, la mayoría de los cuales quedan atrapados en el tejido hepático a través del sistema venoso portal, lo que provoca una reacción granulomatosa y fibrosis [3]. La fibrosis hepática y la hipertensión portal resultante son las principales causas de mortalidad asociadas con esta enfermedad crónica [4]. Esclarecer los mecanismos que dan como resultado la fibrosis hepática puede conducir a estrategias de intervención más efectivas para la esquistosomiasis y una variedad de enfermedades fibróticas.

Las células estrelladas hepáticas (HSC) son los principales efectores de varios tipos de fibrosis hepática [5], incluida la fibrosis hepática inducida por la infección por esquistosomas [6]. Las HSC quiescentes son células perisinusoidales residentes ubicadas en el espacio subendotelial entre los hepatocitos y las células endoteliales sinusoidales, y estas células se caracterizan por la presencia de gotitas de vitamina A citoplasmática [7]. Tras la activación, las HSC se transforman gradualmente en miofibroblastos proliferativos, contráctiles y fibrogénicos [8]. La lesión hepática estimula una variedad de citocinas y factores de crecimiento que activan las HSC para producir α-actina de músculo liso (α-SMA) y secretar un exceso de matriz extracelular (ECM), lo que resulta en fibrosis hepática [9, 10]. Se ha demostrado que la infección por esquistosomas activa las HSC distribuidas por la periferia de los granulomas inducidos por huevos [11]. Estudios previos sugirieron que el factor de crecimiento transformante-β1 (TGF-β1) era la citoquina efectora de la fibrosis hepática inducida por esquistosoma, y sigue siendo la citoquina fibrogénica clásica que impulsa la activación de las HSC [12,13,14]. El bloqueo de la activación de las HSC se ha convertido en una de las principales estrategias para las intervenciones terapéuticas para la fibrosis hepática [15].

Los microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes endógenos que regulan negativamente la expresión génica mediante el emparejamiento de bases con la región 3 'no traducida de su ARN mensajero (ARNm) diana [16, 17]. La evidencia creciente ha demostrado que los miARN desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis celular en condiciones normales y de enfermedad [18]. La desregulación de la expresión de miARN está involucrada en la fibrosis en múltiples sistemas de órganos, incluida la vasculatura (fibrosis pulmonar), el hígado y los riñones [19,20,21,22]. Varios estudios demostraron que los miARN desempeñan un papel crucial en la patogenia de la fibrosis hepática y pueden ser dianas terapéuticas útiles [23, 24]. Nuestros hallazgos anteriores indicaron que el aumento de la expresión de miR-182 promovió la activación de HSC al dirigirse a FOXO1, lo que resultó en la inducción de fibrosis hepática [25]. La familia miR-29 consta de miR-29a, miR-29b y miR-29c, que se redujeron significativamente en hígados fibróticos, como se demostró en fibrosis hepática humana y dos modelos diferentes de lesión hepática inducida por ligadura de conductos biliares (BDL) y tetracloruro de carbono (CCl4) [22, 26, 27]. Sin embargo, no hay evidencia experimental que demuestre que miR-29a está involucrado en la aparición o progresión de la fibrosis hepática inducida por la infección por esquistosomas.

El homólogo rotonda 1 (Robo1) es un miembro de la familia molecular de receptores de adhesión de células neurales, y se expresa en varios tipos de células [28, 29]. Robo1 es un regulador crítico en múltiples procesos biológicos, incluida la proliferación, diferenciación y migración celular [30, 31]. Robo1 está relacionado con varios tipos de cáncer [32, 33] y enfermedades crónicas, incluida la enfermedad renal [34] y la fibrosis hepática [35]. Nuestros resultados anteriores indicaron que microRNA-29a-3p (miR-29a-3p) regulaba a la baja la expresión de Robo1 para inhibir la proliferación, migración, invasión, progresión tumoral y metástasis de células de carcinoma hepatocelular [36]. A la luz de estos hallazgos, planteamos la hipótesis de que miR-29a-3p y Robo1 estaban involucrados de manera crítica en la fibrosis hepática inducida por esquistosomiasis. El presente estudio utilizó S. japonicum en humanos y ratones para investigar el papel de miR-29a-3p y Robo1. Utilizamos ratones knock-in condicionales MIR29A y ratones inyectados con un agomir miR-29a-3p para investigar nuestra hipótesis y dilucidar las vías de patogenia molecular de miR-29a-3p y Robo1 en los cambios fibróticos de los hígados humanos y de ratón tras la exposición al esquistosoma. infección.

Se recolectaron muestras de biopsia hepática del Hospital Tongji, Tongji Medical College, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, entre septiembre de 2015 y agosto de 2019. Se obtuvieron muestras de biopsia en cuña de porciones normales del hígado de siete pacientes sin carcinoma metastásico de hígado (3 carcinomas de colon y 4 carcinomas gástricos) como controles. Se recogieron muestras de hígado fibrótico de nueve pacientes con esquistosomiasis crónica. El estado patológico de los tejidos se confirmó mediante diagnóstico histopatológico. Los criterios de exclusión del estudio fueron pacientes con otros tipos de hepatitis y enfermedad hepática asociada con el consumo de drogas o alcohol. A menos que se indique lo contrario, los valores n se refieren al número de pacientes de los que se obtuvo tejido. Debido al número limitado de muestras de tejido, no todas las muestras se incluyeron en todos los protocolos de estudio. Las características demográficas de los pacientes inscritos se resumen en la Tabla 1.

La generación de la línea de ratón knock-in condicional MIR29A humana mediante CRISPR/Cas9 se subcontrató a Cyagen Biosciences (Suzhou, China). Los ratones se crearon con el trasfondo genético C57BL/6J. El ARNg (5′-GAACACTAGTGCACTTATCCTGG-3′) del locus Hipp11 (H11), el vector donante que contiene el casete "CAG-loxP-Stop-loxP-human MIR29A-polyA" y el ARNm de Cas9 se inyectaron conjuntamente en ratones fertilizados óvulos para generar descendencia selectiva condicional. En el archivo adicional 1: Fig. S1 se muestra una representación esquemática de la estrategia de focalización.

En este estudio se utilizaron ratones hembra de seis semanas de edad. Se obtuvieron ratones C57BL/6J de tipo salvaje (WT) de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing, China). Cyagen construyó ratones knock-in condicionales MIR29A humanos. Todos los animales se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos con alimentos y agua estándar de laboratorio disponibles ad libitum. Para inducir la infección, siete ratones MIR29A hembra de 6 semanas de edad y siete ratones WT C57BL/6J hembra de la misma edad fueron expuestos percutáneamente a 16 ± 1 cercarias de S. japonicum (cepa de China continental) obtenidas de caracoles Oncomelania hupensis infectados comprados en el Instituto de Nanjing. de Prevención y Control de la Esquistosomiasis (Nanjing, China). Siete ratones no infectados emparejados por edad y sexo se usaron como controles.

Para determinar si miR-29a-3p fue suficiente para revertir la fibrosis hepática inducida por huevo, se utilizó un agomir miR-29a-3p (RiboBio, Guangzhou, China). El agomir miR-29a-3p y el agomir de control negativo (NC) se disolvieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se diluyeron en PBS hasta una concentración de baño final de 10 nmol/500 μl. Los ratones infectados fueron tratados por vía oral con 300 mg/kg de praziquantel durante 2 días consecutivos para matar los parásitos a las 6 semanas posteriores a la infección, y los ratones recibieron miR-29a-3p agomir o NC agomir a una dosis de 10 nmol por ratón o 500 l de PBS a través de la vena de la cola cada 4 días durante 28 días. Los ratones se recogieron 10 semanas después de la infección para su posterior análisis.

Para estimar la carga de huevos, se digirieron 0,2 g de cada hígado durante la noche con 20 ml de hidróxido de potasio al 4% y se contó el número de huevos bajo un microscopio. El total de huevos por gramo en el hígado se calculó con la siguiente fórmula: el número de huevos calculado × 5. El índice hepático o esplénico se calculó con la siguiente fórmula: (peso total del hígado o el bazo del ratón/peso total del cuerpo del ratón) × 100% [12, 37, 38]. El tamaño de los granulomas de huevo se midió en secciones H&E de Mayer utilizando un ocular de medición calibrado, y la extensión de la fibrosis se evaluó mediante la tinción tricrómica de Masson de las secciones, como se describió previamente [12]. La puntuación de fibrosis total se determinó multiplicando la densidad y el área de cada granuloma (para una puntuación máxima de 16). El contenido de hidroxiprolina en el hígado se detectó usando un kit de ensayo colorimétrico de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China).

Se tomaron muestras de aproximadamente 1 ml de sangre de ratones mediante extirpación del globo ocular. La sangre se incubó durante 4 h a temperatura ambiente para permitir la formación de coágulos y luego se centrifugó (3500 RPM, 10 min) para separar el suero del coágulo. Los niveles séricos de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) se midieron utilizando un analizador automático Siemens Advia 1650.

El hígado se digirió inicialmente in situ con colagenasa tipo IV al 0,05 % a 37 °C con baño agitado durante 30 min. Los hepatocitos se aislaron mediante centrifugación de la suspensión celular resultante a 50 x g durante 3 min y se purificaron mediante centrifugación a 50 x g durante 2 min. Después de sedimentar los hepatocitos, el sobrenadante que contenía células no parenquimatosas se centrifugó a 450 xg durante 8 min. Las HSC se aislaron de células no parenquimatosas utilizando un gradiente de yodixanol al 15 % (p/v) y al 11,5 % (p/v) (OptiPrep; Stemcell Technologies, Vancouver, Columbia Británica, Canadá) a 1450 × g durante 20 min. Para purificar aún más las HSC, agotamos las HSC de las células de Kupffer (KC) utilizando un anticuerpo anti-CD271 conjugado con biotina (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) y MicroBeads anti-biotina (Miltenyi Biotec). La pureza fue > 97% y la viabilidad fue > 95%. Los resultados representativos para la purificación de HSC se muestran en el archivo adicional 2: Fig. S2.

LX-2 es una línea celular bien caracterizada derivada de HSC humanas, y estas células se adquirieron del Centro de Recolección de Células de la Universidad de Wuhan (China). Las HSC primarias y las células LX-2 se sembraron en placas de plástico y se cultivaron en DMEM (Gibco, Gaithersburg, MD, EE. UU.) complementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS; Gibco, Gaithersburg, MD, EE. estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Los cultivos celulares se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2.

Las células LX-2 (2,5 × 105 células/pocillo) se sembraron en placas de seis pocillos con o sin la presencia de TGF-β1 recombinante (PeproTech). Para determinar los efectos de miR-29a-3p in vitro, se transfectaron células LX-2 con hsa-miR-29a-3p exógeno (miRBase: MIMAT0000086). Las células se transfectaron con imitadores de miR-29a-3p 50 nM, inhibidores de miR-29a-3p 100 nM o sus controles negativos utilizando un kit de transfección riboFECT™ CP (RiboBio, Guangzhou, China) como se describió anteriormente [39]. Brevemente, 10 × tampón riboFECT™ CP se diluyó a 1 ×. El sistema de transfección fue la mezcla de 1 × tampón riboFECT™ CP, reactivo riboFECT™ CP e imitador (50 nM) o inhibidores (100 nM), y la mezcla se transfectó en células LX-2; 48 h después de la transfección, las células de cada grupo experimental se volvieron a suspender, recolectar y someter a experimentos posteriores.

Muestras de hígado humano y de ratón se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 24 h, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 µm de espesor. Para la inmunohistoquímica, se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (PeproTech Inc., EE. UU.) para la inmunotinción con los siguientes anticuerpos primarios: anti-Robo1 policlonal de conejo (1:50, ab7279, Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.), anti-colágeno I policlonal de conejo (1:100, 14695-1-AP, ProteinTech, Chicago, IL, EE. UU.) y anti-α-SMA monoclonal de conejo (1:500, ab108424, Abcam). Para la tinción de inmunofluorescencia, las secciones de tejido se incubaron con anticuerpos primarios contra Robo1 (1:50, ab7279, Abcam), α-SMA (1:200, BM0002, Boster Biological Technology, Wuhan, China) y desmina (1:100, ab227651 , Abcam), seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 594 y Alexa Fluor 488 (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Todas las secciones se tiñeron con 1 μg/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma-Aldrich) para visualizar los núcleos celulares. Se incluyeron al menos tres secciones de hígado en cada grupo. Las secciones teñidas se observaron con un microscopio (Nikon Eclipse Ci) y las imágenes se capturaron con una cámara digital de alta resolución (Nikon digital Sight DS-FI2).

El ARN total se aisló utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) se realizó como se describió anteriormente [40]. Los niveles de expresión de Robo1, Col1α1, Col3α1, α-SMA y TGF-β1 se determinaron con el kit SYBR Green Master Mix (Takara, Kusatsu, Japón). El nivel de expresión de miR-29a-3p se determinó con un kit de inicio Bulge-Loop miRNA qRT-PCR (RiboBio, Guangzhou, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los cebadores específicos de secuencia para U6 y miR-29a-3p fueron sintetizados por RiboBio (Guangzhou, China). Los controles endógenos en este estudio fueron U6 snRNA y GAPDH, y se usó el método 2−ΔΔCt para calcular el cambio en la expresión de todos los ARNm y miR-29a-3p. Las secuencias de los cebadores humanos y de ratón se presentan en la Tabla 2.

La proteína celular total se extrajo en hielo con tampón de lisis RIPA (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) en presencia de inhibidores de proteasa recién agregados (Boster Biological Technology, Wuhan, China) y se cuantificó mediante ensayo BCA (Pierce, Cramlington, Reino Unido). Se separó un total de 30 μg/carril de extracto de proteína mediante PAGE al 10 % (Beyotime Biotechnology, Shanghái, China), seguido de transferencia a una membrana de PVDF (Millipore Corp., Billerica, MA, EE. UU.). La unión no específica se bloqueó con leche descremada al 5% en TBST. La membrana se incubó con anti-Robo1 de conejo (1:1000, ab7279, Abcam, Cambridge, MA) durante la noche a 4 °C. Las membranas se incubaron adicionalmente con anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados con HRP y se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL; Abbkine, Redlands, CA, EE. UU.). Se utilizó anti-GAPDH de conejo (1:2000, 10494-1-AP, ProteinTech, Chicago, EE. UU.) como estándar interno. La densitometría se realizó utilizando el software ImageJ.

Los resultados experimentales se expresan como media ± desviación estándar (DE). La significación estadística entre los grupos experimentales se evaluó mediante la prueba t de Student de dos colas y ANOVA unidireccional con corrección de Tukey. Los resultados clínicos de los pacientes se expresan como mediana y rango intercuartílico. Debido a las distribuciones asimétricas de la mayoría de las variables de los pacientes, se aplicaron la prueba U de Mann-Whitney y la prueba posterior de comparaciones múltiples de Kruskal-Wallis con Dunn. Para datos categóricos, se realizó la prueba de χ2 o la prueba exacta de Fisher para determinar las diferencias entre los grupos. Se utilizó la prueba de rango de Spearman para las correlaciones. Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.) o SPSS 25.0 (SPSS, Chicago, IL). Los valores de p < 0,05 se consideraron significativos.

Para examinar la expresión de miR-29a-3p y Robo1 en muestras de hígado, se realizó una biopsia de hígado en esquistosomiasis crónica y en pacientes de control. Los tejidos fibróticos del hígado tenían áreas fibróticas más grandes y más depósito de colágeno, y se observaron huevos de S. japonicum en las secciones de muestras de hígado de pacientes con esquistosomiasis (Fig. 1A). El nivel de miR-29a-3p en el grupo fibrótico fue significativamente más bajo que el grupo de control, y el nivel de ARNm de Robo1 aumentó (Fig. 1B, C). Se analizaron las inmunotransferencias y se confirmó el nivel de transcripción de Robo1 (Fig. 1D, E). Para evaluar más a fondo los efectos funcionales de Robo1, analizamos Robo1 en tejidos hepáticos mediante inmunohistoquímica. Los tejidos fibróticos mostraron una tinción de Robo1 más fuerte que los tejidos hepáticos de control, y las células positivas para Robo1 se localizaron principalmente en áreas de inflamación y fibrosis (Fig. 1F). La tinción de inmunofluorescencia se utilizó para detectar la expresión de Robo1 y la presencia de HSC, que son las principales células efectoras en varios tipos de fibrosis hepática y desempeñan un papel importante en la vinculación de la inflamación hepática con la fibrogénesis. Se observó la colocalización de Robo1 y HSC, particularmente en los hígados de pacientes con esquistosomiasis (Fig. 1F). Además, encontramos correlaciones significativas entre los niveles de miR-29a-3p y Robo1 y el diámetro de la vena porta y el grosor del bazo en pacientes con esquistosomiasis (Fig. 1G-J). Estos datos sugirieron que miR-29a-3p y Robo1 pueden estar involucrados en la progresión de la fibrosis hepática inducida por esquistosoma.

Disminución de la expresión de miR-29a-3p y aumento de la expresión de Robo1 en tejidos hepáticos de pacientes con esquistosomiasis. A Secciones de tejido hepático incluidas en parafina de pacientes se tiñeron con H&E, tricrómico de Masson y Sirius Red. Barra de escala, 200 μm. B, C El ARN total se extrajo para el análisis de qPCR de los niveles de expresión de miR-29a-3p y Robo1. Control (n = 7), fibrosis (n = 9). D, E La expresión de Robo1 se determinó mediante transferencia Western. La densidad de la imagen se cuantificó utilizando ImageJ y se normalizó a GAPDH. F Se detectó la tinción inmunohistoquímica representativa de Robo1 y la tinción de inmunofluorescencia de la colocalización de Robo1 (verde) con α-SMA (rojo) en secciones de hígado. Las flechas amarillas indican células positivas. Barra de escala, 50 μm. Correlaciones G-J entre los niveles de ARNm de miR-29a-3p y Robo1 y el diámetro de la vena porta y el grosor del bazo en pacientes con esquistosomiasis (n = 9). I El punto más grande muestra datos de dos pacientes. Los datos se presentan como mediana y rango intercuartílico (B, C y E). Todos los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes. La significación se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney (B, C y E) o la prueba de rango de Spearman (G-J). *P < 0,05, ***P < 0,001. miR-29a-3p: microARN-29a-3p; Robo1: Rotonda homóloga 1

Se recogieron muestras de hígado de ratones en varios momentos después de la infección por S. japonicum. Robo1 es un objetivo potencial de miR-29a-3p, según lo predicho por la base de datos TargetScan (www.targetscan.org). Para analizar la relación entre miR-29a-3p y Robo1, evaluamos su expresión durante la progresión de la esquistosomiasis hepática. Encontramos que la expresión de miR-29a-3p comenzó a disminuir en el hígado a las 6 semanas posteriores a la infección y alcanzó sus niveles más bajos en las semanas 8 y 12 (Fig. 2A). Por el contrario, el nivel de expresión de Robo1 se elevó significativamente a las 8 semanas posteriores a la infección (Fig. 2B-D). Además, la regulación a la baja de miR-29a-3p se observó principalmente en hepatocitos aislados y HSC de ratones infectados (Fig. 2E). También analizamos la expresión relativa de miR-29a-3p en diferentes tipos de células hepáticas mediante qPCR y descubrimos que miR-29a-3p estaba presente principalmente en HSC primarias aisladas en lugar de en hepatocitos o KC de hígados no infectados. El nivel de expresión de miR-29a-3p se reguló significativamente a la baja en las HSC de hígados infectados en comparación con los hepatocitos y los KC (Fig. 2F). También realizamos tinción inmunoquímica para Robo1 y observamos que las células productoras de Robo1 se ubicaron principalmente en la periferia de los granulomas de huevo (Fig. 2G). La doble tinción de inmunofluorescencia reveló la colocalización de Robo1 y α-SMA (Fig. 2G), lo que indica que las HSC activadas expresaron Robo1 in vivo. La expresión de miR-29-3p en HSC comenzó a disminuir a las 6 semanas posteriores a la infección, pero el nivel de ARNm de Robo1 aumentó en este momento (Fig. 2H, I). Además, se observó una correlación negativa entre miR-29a-3p y la expresión de Robo1 mediante el análisis de correlación de Spearman (R = − 0,8301, P <0,0001; Fig. 2J). En conjunto, estos resultados sugieren que las HSC activadas en hígados infectados son una fuente de Robo1, y Robo1 es un objetivo potencial de miR-29a-3p en HSC.

Análisis de la expresión de miR-29a-3p y Robo1 en esquistosomiasis murina. A, B La expresión de miR-29a-3p y Robo1 en muestras de hígado durante la infección se detectó mediante qPCR (n = 4–5). La proteína C, D Robo1 se determinó mediante transferencia Western, se cuantificó con ImageJ y se normalizó a GAPDH (n = 6). E, F Se aislaron hepatocitos primarios (Heps), células de Kupffer (KC) y células estrelladas hepáticas (HSC) de hígados no infectados e infectados (8 semanas después de la infección), y el nivel de miR-29-3p se determinó mediante qPCR (n = 3). G Se detectaron tinciones inmunohistoquímicas representativas de Robo1 y tinciones de inmunofluorescencia de colocalización de Robo1 (verde) con α-SMA (rojo) en secciones de hígado. Las flechas amarillas indican células positivas. Barra de escala, 50 μm. H, I Las HSC primarias se aislaron de tejidos hepáticos y la expresión de miR-29a-3p y Robo1 en HSC se detectó mediante qPCR (n = 4). J Correlaciones entre los niveles de ARNm de Robo1 y miR-29a-3p en las HSC de ratones (n = 20). Los datos se presentan como la media ± DE de dos experimentos independientes. La significancia se determinó mediante la prueba t de Student de dos colas (A, B, D, E, H e I) o ANOVA unidireccional con corrección de Tukey para comparaciones entre dos grupos (F) o prueba de rango de Spearman (J). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, en comparación con muestras 0W (A, B, D, H e I). miR-29a-3p: microARN-29a-3p; Robo1: Rotonda homóloga 1; Heps: hepatocitos; KC: células de Kupffer; HSC: células estrelladas hepáticas; ns: no significativo

Nuestro estudio anterior utilizó un ensayo de gen reportero de luciferasa dual para demostrar que Robo1 era un objetivo directo de miR-29a-3p [36]. El presente estudio mostró que la estimulación de las células LX-2 con TGF-β1, que es un gen profibrótico típico en la progresión de la fibrosis hepática, regulaba a la baja la expresión del ARNm de miR-29a-3p y aumentaba el nivel de ARNm de Robo1 (Fig. 3A , B). Además, transfectamos imitadores o inhibidores de miR-29a-3p en células LX-2 y cuantificamos los niveles de miR-29a-3p y Robo1 mediante qPCR y transferencia Western. Como se esperaba, miR-29a-3p se elevó en el grupo miR-mimic y se redujo en el grupo inhibidor de miR (Fig. 3C). Tanto en los niveles de ARNm como de proteína, la elevación de miR-29a-3p redujo claramente la expresión de Robo1, y el agotamiento de miR-29a-3p aumentó significativamente la expresión de Robo1 (Fig. 3D-F). En conjunto, estos datos indican que Robo1 es un objetivo directo de miR-29a-3p en HSC.

Validación de la relación entre miR-29a-3p y Robo1. Las células A, B LX-2 se expusieron a 10 ng/ml de TGF-β1 durante 48 h y la expresión de miR-29a-3p y Robo1 se detectó mediante qPCR (n = 3). Las células CF LX-2 se cultivaron en una placa de plástico y se transfectaron con imitadores de miR-29a-3p 50 nM, inhibidores de miR-29a-3p 100 nM o sus controles negativos (NC) durante 48 h. La expresión de miR-29a-3p y Robo1 se determinó mediante qPCR (n = 3) (C, D) y transferencia Western (n = 3–4) (E, F). Los datos se presentan como la media ± SD. Todos los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes. La significación se determinó mediante la prueba t de Student de dos colas (A–D, F). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. miR-29a-3p: microARN-29a-3p; Robo1: Rotonda homóloga 1

Para evaluar los efectos de la señalización de miR-29a-3p-Robo1 en la patogenia de la fibrosis hepática, establecimos un modelo de fibrogénesis hepática inducida por S. japonicum en ratones knock-in condicionales MIR29A humanos. Los ratones WT se sometieron al mismo tratamiento que los controles. En comparación con los ratones WT, los ratones MIR29A mostraron un nivel más alto de miR-29a-3p en el corazón (aproximadamente 2,0 veces), hígado (aproximadamente 1,8 veces), bazo (aproximadamente 3,2 veces) y riñón (aproximadamente 2,2 veces). ) (Archivo adicional 3: Fig. S3). Los cambios morfológicos en las muestras de hígado y bazo mostraron una respuesta granulomatosa moderada y esplenomegalia en los ratones MIR29A infectados con S. japonicum en comparación con los ratones WT infectados (Fig. 4A). Estos resultados fueron confirmados por los niveles reducidos de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) en suero de ratón y confirmados además por los índices de hígado y bazo (Fig. 4B-E). En particular, los ratones MIR29A infectados con S. japonicum exhibieron una reducción significativa en los depósitos de ECM, como lo muestra la cuantificación de hidroxiprolina (Fig. 4F), la tinción tricrómica de Masson y la tinción con Sirius Red (Fig. 4A, G y H), y un marcado reducción en el tamaño de los granulomas hepáticos como se visualiza por tinción H&E (Fig. 4A, I). Una reducción en la fibrosis se confirmó aún más mediante la tinción inmunohistoquímica y la cuantificación basada en qPCR de la expresión génica asociada a la fibrosis en los hígados de los ratones infectados. La tinción inmunohistoquímica para colágeno I y α-SMA y las cantidades de ARNm de Col1α1, Col3α1, α-SMA y TGF-β1 se redujeron notablemente en los ratones MIR29A infectados con S. japonicum en comparación con los ratones WT infectados (Fig. 4A, J -METRO). Sin embargo, no hubo cambios significativos en la carga de huevos entre los dos grupos infectados, lo que indicó que el tratamiento con miR-29a no tuvo efecto sobre la reproducción y supervivencia del parásito (Archivo adicional 4: Fig. S4A).

Los ratones MIR29A desarrollaron daño hepático y fibrosis con menos facilidad durante la infección por esquistosomas. Los ratones MIR29A y los ratones WT se infectaron por vía percutánea con 16 cercarias de Schistosoma japonicum o no se infectaron. Se recogieron muestras de hígado y bazo 10 semanas después de la infección. Una macrografía de hígados y bazos de ratones MIR29A y ratones WT en los grupos no infectados e infectados. Barra de escala, 1 cm. H&E, tricrómico de Masson y tinción con rojo Sirius de secciones de hígado y tinción inmunohistoquímica para colágeno I y α-SMA. Barra de escala, 50 μm. B, C Se determinaron los índices de hígado y bazo (n = 7). D, E Se midieron los niveles séricos de ALT y AST (n = 7). F Contenido de colágeno en hígados determinado como el contenido de hidroxiprolina (n = 7). G Puntuaciones de fibrosis medidas a partir de la tinción tricrómica de Masson de secciones de hígado (n = 7). H Las áreas positivas para la tinción con Sirius Red se midieron utilizando el software IPP (n = 7). I El tamaño del granuloma se midió a partir de secciones de hígado teñidas con H&E (n = 7). J–M La expresión de Col1α1, Col3α1, α-SMA y TGF-β1 en hígados durante la infección se detectó mediante qPCR (n = 7). Los datos se presentan como la media ± DE de tres experimentos independientes. Las comparaciones múltiples se realizaron mediante ANOVA unidireccional con corrección de Tukey para comparaciones entre dos grupos (BM). **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, en comparación con muestras WT infectadas. miR-29a-3p: microARN-29a-3p; Robo1: Rotonda homóloga 1; ALT: alanina aminotransferasa; AST: aspartato aminotransferasa

Luego evaluamos el nivel de Robo1 en estos ratones. La expresión de ARNm de Robo1 fue significativamente menor en los tejidos hepáticos de ratones MIR29A que en ratones WT en los grupos infectados y no infectados (Fig. 5A). La proteína Robo1 disminuyó en los tejidos hepáticos de los ratones MIR29A infectados con S. japonicum en comparación con los ratones WT infectados, según lo determinado por transferencia Western. Aunque el grupo de ratones MIR29A no infectados mostró una ligera reducción en la expresión de Robo1 en comparación con el grupo de ratones WT no infectados, la diferencia no fue estadísticamente significativa (Fig. 5B, C). Luego investigamos si la sobreexpresión de miR-29a previno la activación de HSC inducida por esquistosomiasis. Aislamos HSC primarias de ratones y descubrimos que las HSC en tejidos de hígado de ratón infectados expresaban Robo1 in vivo según la tinción de inmunofluorescencia. Además, la intensidad de fluorescencia de Robo1 disminuyó en los ratones MIR29A infectados en comparación con los ratones WT infectados (Fig. 5D). Las cantidades de ARNm de Col1α1, Col3α1, α-SMA y TGF-β1 se redujeron notablemente en las HSC infectadas de ratones MIR29A en comparación con los ratones WT (Fig. 5E-H). Estos resultados sugirieron que la sobreexpresión de miR-29a redujo la expresión de Robo1 y previno la activación de HSC inducida por esquistosomiasis.

Los ratones MIR29A fueron más capaces de prevenir la activación de HSC durante la infección por esquistosomas. A El nivel de expresión de Robo1 en hígados se determinó mediante qPCR (n = 7). La proteína B, C Robo1 se determinó mediante transferencia Western, se cuantificó con ImageJ y se normalizó a GAPDH (n = 6). Las HSC primarias D–H se aislaron de tejidos hepáticos de ratones. D Se detectó una tinción de inmunofluorescencia representativa de la colocalización de Robo1 (verde) con α-SMA (rojo) en HSC primarias. Los recuadros muestran una mayor ampliación del área delineada. Barra de escala, 50 μm. E–H La expresión de Col1α1, Col3α1, α-SMA y TGF-β1 en HSC primarias durante la infección se detectó mediante qPCR (n = 7). Los datos se presentan como la media ± DE de dos experimentos independientes. La significación se determinó mediante ANOVA unidireccional con la corrección de Tukey para las comparaciones entre dos grupos (A, C, E–H). ##P < 0,01, en comparación con muestras WT no infectadas. **P < 0,01, ****P < 0,0001, en comparación con muestras WT infectadas. miR-29a-3p: microARN-29a-3p; Robo1: Rotonda homóloga 1

Para verificar si miR-29a-3p contribuía a revertir la fibrosis hepática inducida por el huevo, se infectaron ratones con una dosis moderada de parásitos. A las 6 semanas después de la infección, cuando la fibrosis hepática se manifestó claramente, todos los ratones infectados fueron tratados con praziquantel para matar el parásito y luego se les inyectó miR-29a-3p agomir, NC agomir o PBS cada 4 días durante 28 días y se les realizó la necropsia en 10 semanas post-infección (Fig. 6A). Las muestras de hígado y bazo del grupo tratado con miR-29a-3p agomir exhibieron una respuesta granulomatosa moderada y esplenomegalia (Fig. 6B). El tratamiento antifibrosis redujo significativamente los índices de hígado y bazo (Fig. 6C, D). Además, los ratones tratados con miR-29a-3p agomir mostraron reducciones significativas en los niveles circulantes de ALT y AST, lo que sugiere que el tratamiento alivió el daño hepatocelular (Fig. 6E, F). Los ratones que recibieron el agomir miR-29a-3p exhibieron una reducción significativa en la deposición de ECM, como lo muestra la cuantificación de hidroxiprolina (Fig. 6G), la tinción tricrómica de Masson y la tinción con rojo Sirius (Fig. 6B, H e I), y un marcado reducción en el tamaño de los granulomas hepáticos, como se visualiza en la tinción H&E (Fig. 6B, J). Sin embargo, los hígados no mostraron cambios significativos en la carga de huevos entre los tres grupos infectados (Archivo adicional 4: Fig. S4B). De manera constante, la tinción inmunohistoquímica representativa y el análisis de qPCR demostraron niveles reducidos de expresión de marcadores de fibrosis en los hígados de ratones tratados con miR-29a-3p agomir (Fig. 6B, K–N).

La elevación de miR-29a-3p mediada por agomir de miR-29a-3p revirtió parcialmente la fibrosis hepática inducida por esquistosoma. Los ratones se infectaron percutáneamente con 16 cercarias de Schistosoma japonicum o no se infectaron. Seis semanas después de la infección, los ratones infectados fueron tratados con praziquantel para matar los parásitos y luego recibieron miR-29a-3p agomir, NC agomir o PBS cada 4 días durante 28 días. A los ratones se les realizó la necropsia 10 semanas después de la infección. A Cronograma de infección parasitaria y administración de antiparasitario o miR-29a-3p agomir y toma de muestra. B Macrografías de hígados y bazos de ratones no infectados, ratones infectados y ratones infectados tratados con miR-29a-3p agomir. Barra de escala, 1 cm. H&E, tricrómico de Masson y tinción con rojo Sirius de secciones de hígado y tinción inmunohistoquímica para colágeno I y α-SMA. Barra de escala, 50 μm. Se determinaron los índices C, D de hígado y bazo (n = 3–5). E, F Se midieron los niveles séricos de ALT y AST (n = 5). El contenido de colágeno G en los hígados se determinó mediante el contenido de hidroxiprolina (n = 4–5). H Puntuaciones de fibrosis medidas a partir de la tinción tricrómica de Masson de secciones de hígado (n = 5). I Las áreas positivas para la tinción con Sirius Red se midieron utilizando el software IPP (n = 5). J Tamaño del granuloma medido a partir de secciones de hígado teñidas con H&E (n = 5). K–N La expresión de Col1α1, Col3α1, α-SMA y TGF-β1 en hígados durante la infección se detectó mediante qPCR (n = 4). Los datos se presentan como la media ± DE de tres experimentos independientes. Las comparaciones múltiples se realizaron mediante ANOVA unidireccional con la corrección de Tukey para las comparaciones entre dos grupos (C–N). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. miR-29a-3p: microARN-29a-3p; Robo1: Rotonda homóloga 1; ALT: alanina aminotransferasa; AST: aspartato aminotransferasa

Como era de esperar, se observó una expresión significativamente elevada de miR-29a-3p en los ratones infectados tratados con miR-29a-3p agomir en comparación con los grupos NC agomir y PBS (7,2 a 9,9 veces) (Fig. 7A), lo que resultó en disminución marcada de la expresión de Robo1, según lo determinado por qPCR y transferencia Western (Fig. 7B-D). Al igual que en los ratones MIR29A, se detectó la colocalización de las HSC Robo1 y α-SMA+ en los hígados de los ratones infectados. Mientras tanto, la expresión de Robo1 en HSC de ratones infectados tratados con miR-29a-3p agomir fue menor que en los ratones infectados tratados con NC agomir o PBS (Fig. 7E). Los niveles de ARNm de Col1α1, Col3α1, α-SMA y TGF-β1 también se redujeron en las HSC infectadas de ratones tratados con miR-29a-3p agomir (Fig. 7F-I). En conjunto, estos datos demostraron que la regulación positiva de miR-29a-3p redujo la expresión de Robo1 y evitó la activación de HSC inducida por esquistosomiasis.

miR-29a-3p La elevación de miR-29a-3p mediada por agomir evitó la activación de HSC durante la infección por esquistosoma. Los niveles de expresión de A, B miR-29a-3p y Robo1 en hígados se determinaron mediante qPCR (n = 3–4). La proteína C, D Robo1 se determinó mediante transferencia Western, se cuantificó con ImageJ y se normalizó a GAPDH (n = 3). E–I Las HSC primarias se aislaron de tejidos hepáticos de ratones. E Tinción de inmunofluorescencia representativa de la colocalización de Robo1 (verde) con α-SMA (rojo) en HSC primarias. Barra de escala, 100 μm. F–I La expresión de Col1α1, Col3α1, α-SMA y TGF-β1 en HSC primarias durante la infección se detectó mediante qPCR (n = 3–4). Los datos se presentan como la media ± DE de dos experimentos independientes. La significancia se determinó mediante ANOVA unidireccional con la corrección de Tukey para las comparaciones entre dos grupos (A, B, D, F–I). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. miR-29a-3p: microARN-29a-3p; Robo1: Rotonda homóloga 1

A continuación, investigamos si miR-29a-3p previno la activación de HSC inducida por TGF-β1. Utilizando una línea celular HSC humana inmortalizada bien validada (LX-2), encontramos que la sobreexpresión de miR-29a-3p atenuó significativamente los niveles de ARNm de Col1α1, Col3α1, α-SMA y TGF-β1 en células LX-2 en presencia de TGF-β1 (Fig. 8A-D). Además, miR-29a-3p imita Robo1 marcadamente regulado a la baja en células LX-2 en presencia de TGF-β1 (Fig. 8E, F). Estos resultados demostraron que la sobreexpresión de miR-29a-3p atenuó la activación de HSC al inhibir las vías de Robo1 tanto in vivo como in vitro.

La sobreexpresión de miR-29a-3p atenuó la activación de HSC al inhibir las vías de Robo1. Las células LX-2 se pretrataron con imitadores de miR-29a-3p 50 nM o sus controles negativos durante 6 h, se agregó TGF-β1 (10 ng/ml) al medio y se determinaron los niveles de expresión de los marcadores de fibrosis y Robo1 después de 48 h de incubación. A–E La expresión de Col1α1, Col3α1, α-SMA, TGF-β1 y Robo1 en células LX-2 se detectó mediante qPCR (n = 3–6). La proteína F Robo1 se determinó mediante transferencia Western, se cuantificó con ImageJ y se normalizó a GAPDH (n = 4). Los datos se presentan como la media ± DE de tres experimentos independientes. Las comparaciones múltiples se realizaron mediante ANOVA unidireccional con la corrección de Tukey para las comparaciones entre dos grupos (A–F). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. miR-29a-3p: microARN-29a-3p; Robo1: Rotonda homóloga 1

Se ha sugerido previamente que la regulación y la función de los miARN son altamente específicas de órganos y tipos de células [41]. Las HSC son la principal fuente de miofibroblastos en el hígado [5]. Nuestros hallazgos proporcionan evidencia de un papel funcional de miR-29a-3p en la fibrosis hepática inducida por esquistosoma humano y murino. Nuestros datos mostraron que miR-29a-3p estaba regulado a la baja en HSC durante la fibrosis hepática, y Robo1 estaba regulado al alza. En particular, nuestros hallazgos sugieren que miR-29a-3p revierte parcialmente la fibrosis hepática inducida por esquistosoma al dirigirse a Robo1 para prevenir la activación de HSC inducida por esquistosomiasis durante la infección.

Los miembros de la familia MiR-29 se consideran fibromiR y se ha demostrado que están desregulados durante el proceso de fibrosis en múltiples órganos [42]. Estas moléculas regulan múltiples isoformas de colágeno y otros componentes de la MEC [43]. En general, la disminución de la expresión de los miembros de la familia miR-29 se asocia con una mayor deposición de ECM y fibrosis en varios tejidos. El papel de la especie miR-29 se estudió ampliamente en modelos animales y biopsias de pacientes con fibrosis hepática [17, 26, 27]. Sin embargo, ningún estudio hasta la fecha ha examinado el papel de miR-29 en la fibrosis hepática causada por la esquistosomiasis. En el presente estudio, encontramos que miR-29a-3p estaba disminuido en tejidos hepáticos con fibrosis hepática inducida por esquistosomiasis. Estudios previos identificaron que Robo1, como un objetivo potencial de miR-29a-3p, era un gen objetivo de TGF-β1 en células mamarias [44], lo que indicó que Robo1 puede estar involucrado en la progresión de la fibrosis hepática. Mientras tanto, examinamos la expresión de Robo1 en pacientes de control y con esquistosomiasis. Nuestros resultados mostraron que el nivel de expresión de Robo1 fue significativamente mayor en tejidos hepáticos con fibrosis hepática. Además, los niveles de ARNm de miR-29a-3p y Robo1 en los tejidos hepáticos de pacientes con fibrosis se relacionaron con el diámetro de la vena porta y el grosor del bazo, que aumentaron en paralelo con la extensión de la fibrosis hepática [45, 46]. Más importante aún, mostramos que las células productoras de Robo1 se ubicaron principalmente en HSC. Además, encontramos que la expresión de Robo1 en HSC aumentó significativamente después de la infección. Estos resultados sugieren que miR-29a-3p y Robo1 están involucrados en la patogenia de la fibrosis hepática a través de las HSC durante la infección por esquistosomas.

Para confirmar aún más las funciones de miR-29a-3p y Robo1 in vivo, establecimos un modelo murino de infección por S. japonicum basado en información de estudios previos [6, 47]. En comparación con el grupo no infectado, los ratones infectados con esquistosoma mostraron una expresión menor de miR-29a-3p y mayor de Robo1 en los tejidos hepáticos, y estos niveles de expresión se asociaron con la etapa avanzada de la fibrosis hepática. Además, el nivel de expresión de miR-29a-3p se reguló significativamente a la baja en las HSC de ratones infectados en relación con los hepatocitos y los KC. De manera consistente, nuestros datos también indicaron que la producción de Robo1 se localizó principalmente junto con las HSC durante la infección por esquistosomas. Además, la relación de direccionamiento entre miR-29a-3p y Robo1 se confirmó usando HSC primarias de ratón y la línea celular de HSC humana LX-2. Estos resultados respaldan nuestros datos funcionales sobre el papel de la señalización de miR-29a-3p-Robo1 en las HSC y sugieren que esta señalización está involucrada en la patogenia de la fibrosis hepática a través de las HSC durante la infección por esquistosomas.

La activación anormal de las HSC se ha establecido durante mucho tiempo como un evento crítico durante la patogénesis de la fibrosis hepática [5]. Estudios previos demostraron la presencia de HSC activadas en la periferia de los granulomas de huevo de S. japonicum en infecciones murinas y humanas, y estas células son probablemente células efectoras que contribuyen a la fibrosis asociada al granuloma, lo que enfatiza la importancia de los moduladores de células estrelladas en la progresión de la enfermedad. esquistosomiasis hepática [6]. La creciente evidencia sugiere que miR-29a tiene actividad antifibrótica. Huang et al. informaron que los ratones transgénicos que sobreexpresan miR-29a mejoraron la fibrosis hepática al modular el fenotipo profibrogénico de las HSC después de BDL o una dieta rica en grasas [48, 49]. Un estudio prometedor demostró una recuperación acelerada de la fibrosis hepática inducida por CCl4 después de la administración de miR-29a a través de la vena de la cola [50]. Nuestro estudio demostró que la sobreexpresión de miR-29a-3p en ratones infectados con esquistosoma obstaculizó significativamente el daño hepatocelular y la fibrosis hepática. Además, la sobreexpresión de miR-29a-3p redujo significativamente la expresión de Robo1 en HSC activadas y disminuyó la activación de HSC inducida por esquistosomiasis. TGF-β1 es la citocina profibrogénica más potente [51]. Estudios previos identificaron que el TGF-β1 desempeñaba un papel importante en la patogenia de la esquistosomiasis [52]. Para investigar la interacción entre miR-29a-3p y Robo1 y el efecto de esta interacción en la activación de HSC, transfectamos un agomir miR-29a-3p en células LX-2, seguido de exposición a TGF-β1. Como era de esperar, encontramos que la sobreexpresión de miR-29a-3p disminuyó significativamente la expresión de Robo1 y colágeno inducida por TGF-β1. Estos datos demostraron colectivamente que la señalización de miR-29a-3p-Robo1 en HSC medió en la patogenia de la fibrosis hepática, y la sobreexpresión de miR-29a-3p tuvo un efecto beneficioso sobre la fibrosis hepática inducida por esquistosoma al reducir la expresión de Robo1 y prevenir la activación de HSC durante la infección.

Como se ilustró anteriormente, nuestros resultados proporcionan evidencia tanto experimental como clínica de que la vía de señalización de miR-29a-3p-Robo1 en las HSC desempeña un papel importante en el desarrollo de la fibrosis hepática y sugiere fuertemente que la sobreexpresión de miR-29a-3p puede revertir la inducida por esquistosomas. fibrosis hepática al suprimir la activación de HSC durante la infección. Aunque el praziquantel puede atacar y eliminar eficazmente los esquistosomas, la progresión de la fibrosis hepática persiste [53]. Hasta la fecha, no existen terapias antifibróticas aprobadas. Nuestros datos demostraron claramente que la sobreexpresión de miR-29a-3p alivió dicha fibrosis hepática al suprimir la activación de HSC. Por tanto, miR-29a-3p constituye un candidato prometedor para el desarrollo de herramientas terapéuticas para prevenir o tratar la fibrosis hepática. Sin embargo, se justifican claramente más estudios.

Nuestros resultados revelaron que la señalización de miR-29a-3p-Robo1 en HSC medió en la patogenia de la fibrosis hepática, y la sobreexpresión de miR-29a-3p tuvo un efecto beneficioso sobre la fibrosis hepática inducida por esquistosoma al reducir la expresión de Robo1 y prevenir la activación de HSC durante la infección. Por lo tanto, nuestro estudio proporciona información sobre los mecanismos de regulación de miR-29a-3p de la fibrosis hepática por esquistosomiasis y destaca el potencial de miR-29a-3p como intervención terapéutica para enfermedades fibróticas.

Todos los datos que respaldan las conclusiones de este estudio se incluyen en el artículo.

Alanina aminotransferasa

Aspartato aminotransferasa

α-actina del músculo liso

Ligadura del conducto biliar

Tetracloruro de carbono

La matriz extracelular

Suero bovino fetal

hepatocitos

Células estrelladas hepáticas

Células Kupffer

microARN

MicroARN-29a-3p

Solución salina tampón de fosfato PBS de ARN mensajero

Solución salina tampón de fosfato

Rotonda homóloga 1

Schistosoma japonicum

Transformando el factor de crecimiento-β1

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Agradecemos al personal del Departamento de Parasitología, Facultad de Medicina Básica, Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, por su ayuda con las infecciones parasitarias.

Este estudio fue apoyado por el Proyecto principal de ciencia y tecnología nacional (n.º 2014ZX10005001; n.º 2018ZX10302204-001) y el proyecto de investigación científica de la Comisión de Salud de la provincia de Hubei (n.º WJ2021M20). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Departamento e Instituto de Enfermedades Infecciosas, Hospital Tongji, Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, Wuhan, China

Hongyan Kong, Dandan Xiang, Shuaiwen Huang, Xin Xu, Jinan He, Lanyue Pan, Ran Tao, Haijing Yu y Jiaquan Huang

Instituto del Cáncer, Laboratorio Clave de Shenzhen para la Investigación Traslacional del Cáncer Gastrointestinal, Universidad de Pekín Hospital de Shenzhen, Universidad de Pekín de Shenzhen, Centro Médico de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong (PKU-HKUST), Instituto de Investigación del Cáncer, Laboratorio de la Bahía de Shenzhen, Shenzhen, China

Canción Qiqin

Departamento de Gastroenterología, Hospital Popular de Jianshi, Enshi, China

wenjianghu

Departamento de Pediatría, Hospital Tongji, Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, Wuhan, China

shusen guo

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HK, QS y JH diseñaron el estudio. HK, QS, WH, SG, DX, SH, XX, JH, LP, RT y HY adquirieron los datos experimentales. HK y JH contribuyeron al análisis de datos y escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Jiaquan Huang.

El estudio en humanos fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Tongji, Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong (número de permiso: 20150103). Los estudios se realizaron de acuerdo con la Declaración de Helsinki y con el consentimiento informado por escrito de cada paciente. Todos los experimentos con animales se realizaron en estricta conformidad con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Colegio Médico Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong. (IACUC núm. 629).

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

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Diagrama esquemático de la construcción del ratón MIR29A. El locus Hipp11 (H11) está ubicado dentro de una región intergénica entre los genes Eif4enif1 y Drg1 en el cromosoma 11 de ratón. El gen MIR29A humano (NCBI ReferenceSequence: NR_029503.1) está ubicado en el cromosoma 7 humano. Para el modelo de inserción condicional, el casete "CAG-loxP-Stop-loxP-human MIR29A-polyA" se insertó en el locus H11 (~ 0,7 kb 5' del gen Eif4enif1 y ~ 4,5 kb 3' del gen Drg1). Cas9 y gRNA se inyectaron conjuntamente en óvulos fertilizados con un vector de orientación para la producción de ratones. Los cachorros fueron genotipados por PCR seguido de análisis de secuenciación.

Pureza de las HSC aisladas. (A, B) Resultados representativos para la purificación de HSC por citometría de flujo e inmunofluorescencia. Los recuadros muestran una mayor ampliación del área delineada. Barra de escala, 50 μm.

Los ratones MIR29A tenían niveles más altos de miR-29a-3p en diferentes órganos. Los niveles de expresión de miR-29a-3p en diferentes órganos de ratones WT y ratones MIR29A se determinaron mediante qPCR. Los datos se presentan como la media ± DE de tres experimentos independientes. La significación se determinó mediante la prueba t de Student de dos colas. ***P < 0,001, ****P < 0,0001. miR-29a-3p: microARN-29a-3p.

Alteración de la carga parasitaria en los diferentes grupos durante la infección por esquistosomas. Alteración de la carga parasitaria en los ratones WT y ratones MIR29A infectados. Alteración de la carga parasitaria tras la administración del agomir miR-29a-3p. Los datos se presentan como la media ± DE de tres experimentos independientes. La significación se determinó mediante la prueba t de Student de dos colas (A) o ANOVA unidireccional con corrección de Tukey para comparaciones entre dos grupos (B). miR-29a-3p: microARN-29a-3p.

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Reimpresiones y permisos

Kong, H., Song, Q., Hu, W. et al. MicroRNA-29a-3p previene la fibrosis hepática inducida por Schistosoma japonicum al dirigirse al homólogo 1 de Roundabout en las células estrelladas hepáticas. Vectores de parásitos 16, 184 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05791-4

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Recibido: 26 enero 2023

Aceptado: 27 de abril de 2023

Publicado: 06 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05791-4

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