Regulación del probiótico viable/inactivado/lisado Lactobacillus plantarum H6 sobre la microbiota intestinal y sus metabolitos en ratones hipercolesterolémicos - Grupo Co., Ltd de los laboratorios de minería de Foshan

npj Science of Food volumen 6, Número de artículo: 50 (2022) Citar este artículo

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La evidencia sugiere que las intervenciones con probióticos reducen el riesgo de enfermedades no transmisibles (ENT). Sin embargo, su efecto terapéutico y mecanismo aún no están claros. Para evaluar el efecto hipocolesterolémico de Lactobacillus plantarum H6 (Lp H6), una nueva cepa comercial patentada capaz de prevenir la hipercolesterolemia, y su mecanismo en profundidad, se prepararon tres estados de la cepa, a saber, viable (vH6), inactivado por calor (iH6 ) y células bacterianas lisadas ultrasónicamente (uH6). Los resultados mostraron que las células v/i/uH6 podrían reducir los niveles de lípidos en sangre sérica y hepática, aliviar el daño hepático y mejorar los índices de la prueba de tolerancia a la glucosa (GTT) y la prueba de tolerancia a la insulina (ITT). Las células v/i/uH6 mejoraron la composición microbiana intestinal y redujeron significativamente la relación Firmicutes a Bacteroidetes (relación F/B) en las heces. En particular, Muribaculaceae puede ser un biomarcador potencial para la reducción efectiva del colesterol. Además, se encontró la recuperación de estos índices bioquímicos y del microbioma intestinal después del trasplante de microbiota fecal (FMT) utilizando heces de ratones tratados con vH6. Las células v/i/uH6 incrementaron el metabolismo de la flora intestinal de vitaminas-cofactores, así como de aminoácidos, al mismo tiempo que disminuyeron el contenido relativo de ácidos biliares primarios. El análisis de correlación de Pearson mostró que norank_f__Muribaculaceae y Lactobacillus tenían una correlación negativa con los niveles de lípidos en sangre. En general, las células v/i/uH6 fueron eficaces para mejorar la hipercolesterolemia en ratones, y este efecto se atribuyó en parte a la regulación de la microbiota intestinal y los metabolitos relacionados con el metabolismo de los lípidos. Nuestros hallazgos proporcionaron una base teórica para el desarrollo industrial de probióticos y postbióticos y el tratamiento de enfermedades relacionadas con el colesterol.

El nivel de colesterol en el cuerpo humano juega un papel vital en la función y las células normales, pero los niveles excesivos pueden provocar problemas en el metabolismo de los lípidos y aumentar el riesgo de enfermedades no transmisibles (ENT), como las enfermedades cardiovasculares (CVD), la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) , obesidad, etc.1. Según las Estadísticas Sanitarias Mundiales en 2021, las ECV siguen siendo la principal causa de muerte por ENT, especialmente en los países en desarrollo de bajos ingresos2. Entonces, cómo mantener efectivamente los niveles normales de colesterol es un tema importante de salud pública. Las estatinas y los fibratos son los medicamentos para reducir el colesterol más utilizados, pero el uso a largo plazo puede causar efectos secundarios graves, incluido el aumento del riesgo de rabdomiolisis, síndrome alérgico y deterioro cognitivo3.

En los últimos años, el efecto reductor del colesterol de los probióticos ha llamado la atención de los investigadores4. En comparación con la terapia farmacológica, sus características de alta eficacia, seguridad y economía han sido favorecidas por los consumidores. Los estudios han demostrado que Lactobacillus plantarum NCU116 también puede regular eficazmente el metabolismo de los lípidos en ratas con hiperlipidemia, lo suficiente como para reducir los niveles de colesterol total (CT) en ratas con hiperlipidemia, y tiene el potencial de regular el metabolismo de los lípidos, el hígado y la morfología del tejido adiposo5. Tanto el Lacticaseibacillus casei vivo como el inactivado por ultrasonido pudieron reducir los niveles de CT y controlar la resistencia a la insulina en ratas macho alimentadas con una dieta alta en grasas6. Los probióticos pueden reducir el colesterol mediante la regulación de la microbiota intestinal y sus metabolitos7. El cambio de la microbiota intestinal, que se conoce como el "segundo cerebro" del cuerpo humano, puede afectar la homeostasis energética, la inflamación sistémica, el metabolismo de los lípidos, el equilibrio de la glucosa y la sensibilidad a la insulina del huésped8. Además, la riqueza y diversidad de la microbiota intestinal, especialmente la relación entre Firmicutes y Bacteroidetes (relación F/B)9, puede mejorar significativamente tomando probióticos. El uso del trasplante de microbiota fecal (FMT) ha demostrado que la regulación de la microbiota intestinal puede tratar eficazmente el síndrome metabólico10.

En la actualidad se han desarrollado muchos productos probióticos para regular el colesterol, pero todos ellos se centran en bacterias vivas para evitar que el colesterol suba. Además, algunos estudios encontraron que las bacterias muertas y sus metabolitos, llamados "postbióticos"11,12, aún pueden tener actividad fisiológica13. Anteriormente, nuestro equipo identificó una cepa probiótica Lactobacillus plantarum H6 (Lp H6, CGMCC 18205, número de patente ZL 201910955071. X) con buena tolerancia en el tracto digestivo. La cepa H6 se ha convertido en un producto básico. La capacidad de eliminación de colesterol in vitro del H6 alcanzó el 92,07 %, y las pruebas en animales han demostrado que puede mejorar eficazmente la disbiosis de la microbiota intestinal y el daño hepático causado por una dieta rica en colesterol14. En este estudio se evaluó el efecto regulador de la Lp H6 viable, inactivada y lisada ultrasónicamente sobre el colesterol y su influencia sobre la microbiota intestinal, y se estudiaron sistemáticamente los efectos terapéuticos de la Lp H6 en ratones hipercolesterolémicos, lo que proporcionó una base teórica para el desarrollo industrial. desarrollo de probióticos y el tratamiento de enfermedades del colesterol.

En comparación con el grupo ND, el grupo HCD no tuvo diferencias significativas en la ingesta de alimentos y el aumento de peso (Figura complementaria 1a), mientras que TC y triglicéridos (TG) en suero e hígado de ratones en el grupo HCD aumentaron significativamente, y el contenido fue de ~2 a 3 veces mayor que la del grupo ND (Fig. 1a), lo que indica que el modelo de ratones con hipercolesterolemia se ha establecido con éxito.

a Niveles de TC y TG en suero y de TC y TG en hígado en ratones modelo con hipercolesterolemia. Los datos se representan como la media ± SEM (n = 6). ***P < 0,001, ****P < 0,0001 frente al ND de control. b Niveles séricos de TC, TG, LDL-C, colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL-C), ALT y AST después de 12 semanas. c Peso del hígado, TC y niveles de TG. Los datos se representan como la media ± SEM (n = 8). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 frente al control HCD_ND; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 frente al control FMT1. HCD_ND se refiere al grupo de ratones modelo de hipercolesterolemia; v/i/uH6 se refiere a células bacterianas viables (vH6), inactivadas por calor (iH6) y lisadas ultrasónicamente (uH6); FMT1/2/3 se refiere al uso de heces de los grupos HCD_ND, Sim y vH6, respectivamente.

En comparación con el grupo HCD_ND, después de 12 semanas de tratamiento con v/i/uH6 y FMT3, los índices fisicoquímicos relacionados con el metabolismo de los lípidos en suero de ratones mejoraron (Fig. 1b), la CT disminuyó significativamente, especialmente la CT sérica en el FMT3 grupo, que disminuyó en un 43,98% (P < 0,05). Los niveles séricos de TG de los ratones que recibieron vH6 y FMT3 se redujeron significativamente en un 18,69 % y un 17,17 %, respectivamente (P < 0,05). En comparación con el grupo HCD, los niveles de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C) fueron significativamente más bajos cuando se les administró vH6, uH6 y FMT3 (0,18–0,34 mmol/L frente a 1,5 mmol/L). Además, v/i/uH6 y FMT3 redujeron significativamente los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) en suero de ratones, especialmente aquellos que recibieron vH6 e iH6 (10,76 U/L y 11,58 U/L, respectivamente). vH6 y FMT3 redujeron significativamente los niveles séricos de aspartato aminotransferasa (AST) (P < 0,05).

v/i/uH6 y FMT3 mejoraron de manera similar el contenido de peso del hígado, TC y TG (excepto para iH6) de ratones (Fig. 1c). Por ejemplo, cuando se administró vH6 e iH6, el peso del hígado disminuyó en un 21,27 % y un 22,10 %, respectivamente (P < 0,05). v/i/uH6 disminuyó TC en un 30,44 %, 24,49 % y 35,67 %, respectivamente (P < 0,05). En general, v/i/uH6 y FMT3 mejoraron las propiedades fisicoquímicas séricas y hepáticas, incluidos niveles más bajos de TC, TG, LDL-C, ALT, AST en el suero y TC, TG en el hígado en varios niveles.

Los ratones alimentados con HCD mostraron hepatomegalia con un tono amarillo grisáceo. Sin embargo, v/i/uH6 y FMT3 inhibieron la hepatomegalia, el color (marrón rojizo) y la textura blanda del hígado fueron casi normales. (Figura 2a). La tinción HE mostró que en el grupo HCD, la disposición de las células hepáticas estaba suelta y desordenada, aparecía una gran cantidad de vacuolas grasas de diferentes tamaños y números, las células hepáticas estaban agrandadas, parcialmente necróticas y las células hepáticas estaban gravemente dañadas. (Figura 2b). Cuando los ratones fueron tratados con v/i/uH6 y FMT3, el daño de las células del hígado se redujo obviamente, las gotas de grasa en el citoplasma se redujeron y las células del hígado se organizaron de forma ordenada.

a Imágenes de hígados de ratones después de diferentes tratamientos. b, c Imágenes representativas de tinción H/E y tinción Oil Red O de secciones de hígado (400×, barra de escala = 50 μm). Algunas porciones locales dañadas de hepatocitos se indican mediante flechas amarillas en la tinción H/E. d Imágenes representativas de tinción inmunofluorescente de secciones de hígado usando anti-UCP1 (400×, barra de escala = 50 μm). HCD_ND se refiere al grupo de ratones modelo de hipercolesterolemia; v/i/uH6 se refiere a células bacterianas viables (vH6), inactivadas por calor (iH6) y lisadas ultrasónicamente (uH6); FMT1/2/3 se refiere al uso de heces de los grupos HCD_ND, Sim y vH6, respectivamente.

La tinción con aceite rojo O mostró que las gotas de lípidos hepáticos en hepatocitos de ratones HCD mostraron acumulación de partículas y fusión en escamas (Fig. 2c). Sin embargo, cuando los ratones fueron tratados con vH6, iH6 y FMT3, las gotas de lípidos fueron significativamente menores, el tamaño fue más pequeño y la distribución fue irregular y desigual.

La expresión de UCP1 en tejidos hepáticos se detectó mediante tinción inmunohistoquímica (Fig. 2d). En comparación con HCD_ND y FMT1, la expresión de UCP1 mejoró significativamente en los ratones que recibieron vH6, iH6 y FMT3, y hubo una gran área de partículas marrones positivas en los tejidos hepáticos. En conclusión, se puede observar que v/i/u H6 y FMT3 mejoran la degeneración del hígado en diversos grados mediante la tinción de secciones de hígado.

En el grupo HCD, los niveles de glucosa de los ratones se alteraron y los niveles de glucosa en sangre aumentaron considerablemente. v/i/uH6 y FMT3 redujeron los valores del área bajo la curva (AUC) correspondientes a la tolerancia a la glucosa en ratones, que se redujeron significativamente en un 23,89 % y 20,50 % en los grupos uH6 y FMT3, respectivamente (P < 0,05, Fig. 3a, b). De manera similar, v/i/uH6 y FMT3 mejoraron la tolerancia a la insulina de los ratones, como lo demuestra la reducción de la glucosa y los valores de AUC más bajos en la prueba de tolerancia a la insulina, que disminuyeron significativamente en un 19,53 %, 15,10 % y 8,35 % en el vH6, iH6 , y grupos FMT3, respectivamente (P <0.05, Fig. 3c, d). Estos resultados indican que v/i/uH6 y FMT3 pueden mejorar la tolerancia a la glucosa y la insulina en ratones hipercolesterolémicos.

a, b GTT: a los ratones en ayunas durante la noche se les inyectó glucosa (2 mg/kg) por vía intraperitoneal. La glucosa en sangre se determinó a los 0, 15, 30, 60 y 120 minutos. c, d ITT: a los ratones en ayunas durante 4 h se les inyectó insulina (0,75 U/kg). La glucosa en sangre se determinó a los 0, 15, 30, 60 y 120 minutos. Se calculó el valor AUC. Los datos se presentan como la media ± SEM (n = 8). *P < 0,05, **P < 0,01vs. controlar HCD_ND; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 frente al control FMT1. HCD_ND se refiere al grupo de ratones modelo de hipercolesterolemia; v/i/uH6 se refiere a células bacterianas viables (vH6), inactivadas por calor (iH6) y lisadas ultrasónicamente (uH6); FMT1/2/3 se refiere al uso de heces de los grupos HCD_ND, Sim y vH6, respectivamente.

Se identificó un total de 1061 OTU, incluidos 18 filos, 33 clases, 78 órdenes, 112 familias, 196 géneros y 305 especies, en la microbiota intestinal de ratones mediante la tecnología de secuenciación 16S rRNA. La diversidad α de la microbiota intestinal de diferentes ratones tratados se evaluó en función de los niveles de OTU. Los índices de Ace, Shannon y Shannoneven de la microbiota intestinal de ratones que recibieron v/i/uH6 y FMT3 fueron significativamente más altos que los de los grupos HCD_ND y FMT1 (Fig. 4a y Fig. 2b complementaria). El análisis de coordenadas principales (PCoA) de la diversidad β mostró que la microbiota intestinal de los ratones que recibieron grupos v/i/uH6 y FMT3 fue similar a la del grupo ND pero significativamente diferente a la de los grupos HCD, HCD_ND y FMT1 (Fig. 4b). En comparación con HCD_ND, v/i/uH6 aumentó la abundancia de microbiota intestinal en ratones y el número de UTO aumentó en un 31,16 %, 39,86 % y 17,63 %, respectivamente (Fig. 4c). Los mapas de calor basados en los niveles de OTU mostraron que la estructura de la microflora intestinal de los grupos HCD, HCD_ND y otros grupos de tratamiento se dividieron claramente en tres partes, y la abundancia comunitaria de v/i/uH6 fue más similar a la de los grupos ND y Sim (Figura 4d). Un análisis adicional de la composición de la microbiota intestinal a nivel de filo (Fig. 4e) mostró que en el grupo HCD, los Firmicutes aumentaron y los Bacteroidota disminuyeron en el intestino, lo que condujo a un aumento de la relación F/B. Mientras que v/i/uH6 redujo la abundancia relativa de Firmicutes en un 5,94 %, 44,96 % y 44,64 % respectivamente, aumentó la abundancia relativa de Bacteroidota en un 234,85 %, 377,05 % y 362,53 % respectivamente, y redujo la relación F/B significativamente en comparación con el grupo HCD_ND.

a Diversidad alfa evaluada por riqueza (ACE) y diversidad (Shannon). b Diversidad beta calculada usando UniFrac ponderado por PCoA. c Diagrama de Venn de OTU en ratones que recibieron v/i/uH6. d Mapa de calor de la abundancia relativa de las 100 UTO principales en ratones que recibieron v/i/uH6. e Abundancia relativa de microbiota a nivel de filo y relación Firmicutes/Bacteroidetes. f Puntuación LDA (LDA > 2,5) en ratones que recibieron v/i/uH6. g Comparación de dos grupos usando una prueba t de Student. h Diagrama de Venn de OTU, mapa de calor de la abundancia relativa de las 100 OTU principales, puntaje LDA y comparación de dos grupos usando una prueba t de Student en grupos de trasplante de microbiota fecal. Los datos se presentan como la media ± SEM (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. HCD_ND se refiere al grupo de ratones modelo de hipercolesterolemia; v/i/uH6 se refiere a células bacterianas viables (vH6), inactivadas por calor (iH6) y lisadas ultrasónicamente (uH6); FMT1/2/3 se refiere al uso de heces de los grupos HCD_ND, Sim y vH6, respectivamente.

El análisis LEfSe mostró diferencias significativas en la estructura de la microbiota intestinal entre los diferentes grupos de tratamiento (Figura complementaria 2f), y se utilizó el análisis discriminante lineal (LDA) para evaluar las bacterias predominantes en los diferentes grupos. Las bacterias dominantes de los ratones que recibieron vH6 fueron Lactobacillus, Coriobacteriaceae_UCG-002 y norank_f__Oscillospiraceae, Muribaculum, unclassified_o__Bacteroidales y Ruminococcus cuando se les administró iH6, y norank_f__Muribaculaceae cuando se les administró uH6 (Fig. 4f). La prueba t de Student mostró que en el grupo HCD_ND, la abundancia de Faecalibaculum, Allobaculum y Turicibacter aumentó significativamente en comparación con el grupo tratado con v/i/uH6 en el que la abundancia de norank_f__Muribaculaceae aumentó significativamente en comparación con la del grupo HCD_ND (Fig. 4g). Además, en comparación con el grupo HCD_ND, i/uH6 aumentó unclassified_o__Oscillospirales y Lachnoclostridium, y vH6 aumentó significativamente Muribaculum, por lo que estas bacterias dominantes podrían ser biomarcadores potenciales para la reducción efectiva del colesterol por Lp

El trasplante de microbiota fecal (FMT) con heces de ratones tratados con vH6 también mejoró la composición microbiana intestinal inducida por HCD (Fig. 4h). En comparación con el tratamiento con FMT1, la cantidad de OTU de microbios intestinales de los ratones tratados con FMT3 aumentó en un 15 %, y el mapa de calor de la distribución comunitaria fue más similar al de los ratones normales y tratados con FMT2. Del mismo modo, la cantidad de Firmicutes disminuyó un 15,45 % y la de Bacteroidota aumentó un 79,3 % en los ratones tratados con FMT3. Las bacterias dominantes de los ratones tratados con FMT3 fueron norank_f__Muribaculaceae, unclassified_f__Ruminococcaceae, unclassified_c__Bacilli e Intestinimonas, de las cuales norank_f__Muribaculaceae también fue la bacteria dominante más abundante de los ratones tratados con uH6. En comparación con el tratamiento con FMT1, FMT3 aumentó la abundancia de Enterorhabdus, Muribaculum, unclassified_c__Bacilli, Coriobacteriaceae_UCG-002 y norank_f__Paracaedibacteraceae. Además, FMT3 disminuyó los niveles de Faecalibaculum, lo cual fue consistente con el grupo tratado con v/i/uH6. Estos resultados indicaron que v/i/uH6 y FMT3 pueden aliviar la disbiosis de la microbiota intestinal de ratones hipercolesterolémicos al regular los microbios intestinales.

La detección no dirigida de metabolitos fecales de ratones se realizó en base a UPLC/Q-TOF-MS/MS. La información de MS y MS/MS se comparó con las bases de datos metabólicas públicas HMDB (http://www.hmdb.ca/) y Metlin (https://metlin.scripps.edu/). Se identificaron un total de 1114 metabolitos fecales. El análisis PLS-DA mostró que los grupos de HCD, HCD_ND y FMT3 estaban obviamente separados de los otros grupos de tratamiento (Fig. 5a), y el modelo de prueba de sustitución mostró que el modelo PLS-DA era confiable (Suplementario fig. 3a). De acuerdo con el mapa de calor, los metabolitos fecales de los ratones que recibieron v/i/uH6 y FMT3 fueron más similares al grupo ND, pero obviamente estaban separados de los grupos HCD, HCD_ND y FMT1 (Figura complementaria 3b). Todos los metabolitos se clasificaron como vitaminas-cofactores, aminoácidos, ácidos biliares y lípidos. En comparación con el grupo HCD_ND, v/i/uH6 aumentó el contenido relativo de seis cofactores de vitaminas, entre los que se incrementaron significativamente el pantotenato y la niacinamida (Fig. 5b). Sin embargo, FMT3 no cambió significativamente el nivel de vitaminas-cofactores (Figura complementaria 3c). En comparación con el grupo HCD_ND, v/i/uH6 aumentó significativamente el contenido de aminoácidos (Fig. 5c), como l-triptófano, l-prolina, l-fenilalanina y l-glutamato, y el contenido de aminoácidos de cadena ramificada ácidos (BCAA), como la l-isoleucina. En términos de ácidos biliares, en comparación con el grupo HCD_ND, v/i/uH6 redujo el contenido de ácidos biliares primarios en un 18,10 %, 13,31 % y 21,00 % respectivamente, y redujo el contenido de ácidos biliares secundarios, como el ácido desoxicólico, Ácido 3-deshidrocólico, ácido 12-cetolitocólico, ácido glicolitocólico. FMT3 tuvo la misma tendencia en la regulación de los ácidos biliares (Fig. 5d). Los metabolitos diferenciales entre los diferentes grupos de tratamiento se examinaron mediante un mapa de calor de grupo y un gráfico de barras VIP (Fig. 5e). Se identificaron ratones tratados con v/i/uH6 y FMT3 para 7, 7, 16 y 4 metabolitos de lípidos notables, respectivamente. En comparación con el grupo HCD_ND, vH6 reguló significativamente cuatro metalolitos de lípidos, a saber, 9,12,13-TriHOME, 9-HOTrE, ácido estearidónico y ácido dodecanodioico. iH6 aumentó significativamente el ácido estearidónico, el ácido dodecanodioico y el alprostadil. uH6 aumentó significativamente la ouabaína uno. FMT3 redujo todos los metabolitos diferenciales en comparación con FMT1. En general, existen similitudes en los metabolitos diferenciales de v/i/uH6 y FMT3, como el ácido elaídico, ácido transvaccénico, ácido estearidónico, etc.

a Análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) basado en los metabolitos microbianos. b–d El contenido relativo de vitaminas-cofactores, aminoácidos y ácidos biliares detectados por el enfoque de metabolómica no dirigida basado en UPLC/Q-TOF-MS/MS. e El mapa de calor de agrupamiento y el mapa de barras VIP de los lípidos diferenciales se compararon entre los dos grupos. f El contenido de ácido caproico. g Análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de metabolitos diferenciales en HCD_ND frente a vH6. Los datos se presentan como la media ± SEM (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. HCD_ND se refiere al grupo de ratones modelo de hipercolesterolemia; v/i/uH6 se refiere a células bacterianas viables (vH6), inactivadas por calor (iH6) y lisadas ultrasónicamente (uH6); FMT1/2/3 se refiere al uso de heces de los grupos HCD_ND, Sim y vH6, respectivamente.

Para la detección dirigida de SCFA, se utilizó un cromatógrafo de gases Thermo TRACE1310-ISQ LT equipado con una columna capilar Agilent HP-INNOWAX. En comparación con el grupo HCD_ND (Fig. 5f), vH6 aumentó el contenido de ácido caproico (P <0.05), ácido acético, ácido propiónico, ácido isobutírico, ácido butírico, ácido valérico y SCFA totales; uH6 aumentó el contenido de ácido acético, ácido propiónico y ácido valérico. En comparación con el grupo FMT1, FMT3 aumentó el contenido de ácido acético y ácido propiónico, aunque ninguna de estas diferencias fue estadísticamente significativa (Figura complementaria 3e).

Los procesos biológicos de los metabolitos fecales se predijeron mediante el análisis de la vía KEGG. El análisis de los metabolitos diferenciales entre los grupos vH6 y HCD_ND reveló que vH6 regulaba la hipercolesterolemia en ratones por muchas vías, incluida la digestión y absorción de vitaminas, la regulación de la lipólisis, la vía de señalización de cAMP, el metabolismo del ácido linoleico, la biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano, la vía de señalización de mTOR, PI3K- Vía de señalización de Akt y biosíntesis secundaria de ácidos biliares. Al igual que vH6, iH6 y uH6 están involucrados en la regulación de las vías metabólicas, como la vía de señalización de cAMP, la secreción de bilis, la regulación de la lipólisis o la vía de señalización de mTOR (Fig. 5g y Fig. 3f complementaria). En relación con FMT1, FMT3 puede regular el metabolismo a través de la secreción de bilis y la biosíntesis secundaria de ácidos biliares. En conclusión, v/i/uH6 mejoró los metabolitos intestinales en ratones con hipercolesterolemia en diferentes grados. En particular, las células v/i/uH6 aumentaron el metabolismo de la flora intestinal de vitaminas-cofactores, así como de aminoácidos, al tiempo que disminuyeron el contenido relativo de ácidos biliares primarios.

Un análisis más detallado de las correlaciones de Pearson entre la microbiota intestinal (los 10 géneros principales a nivel de género) y los indicadores fisicoquímicos de hipercolesterolemia mostró que norank_f__Muribaculaceae y Lactobacillus tenían correlaciones negativas significativas con TC, TG, LDL, ALT, AST y peso del hígado. Turicibacter, Romboutsia y Faecalibaculum tuvieron correlaciones positivas significativas con estos índices (Fig. 6a). Allobaculum también tuvo una relación positiva significativa con LDL, TC hepático y peso hepático. La correlación entre los metabolitos fecales y la estructura de la comunidad microbiana se evaluó mediante un análisis de redundancia (RDA), como se muestra en la Fig. 6b-d y la Fig. complementaria. 4a, b. En el grupo tratado con v/i/uH6, Faecalibaculum, Allobaculum y Turicibacter mostraron una relación negativa significativa con otras bacterias, lo que confirma los hallazgos anteriores. La D-biotina y el ácido fólico tuvieron una fuerte correlación positiva con Lactobacillus, Coriobacteriaceae_UCG-002 y Muribaculum, mientras que las vitaminas-cofactores tuvieron una correlación positiva con las bacterias dominantes de los ratones tratados con v/i/uH6 (Fig. 6b). La l-serina se correlacionó fuertemente con Lactobacillus y Coriobacteriaceae_UCG-002, mientras que los aminoácidos restantes se correlacionaron con bacterias dominantes v/i/uH6 (Fig. 6c). Para los ácidos biliares, el ácido glicolitocólico no tuvo correlación con Bacteroidales no clasificados y Turicibacter. Romboutsia y Faecalibaculum mostraron correlaciones positivas significativas con la mayoría de los ácidos biliares (Fig. 6d). Estos resultados indicaron una fuerte correlación entre la producción y la abundancia de metabolitos fecales y microbios intestinales en ratones hipercolesterolémicos que recibieron v/i/uH6. De manera similar, en el grupo FMT3, se descubrió una correlación entre las comunidades microbianas y los indicadores y metabolitos fisicoquímicos, pero no hubo significación estadística (Figura complementaria 4c-g). En resumen, el análisis de correlación de Pearson mostró que norank_f__Muribaculaceae y Lactobacillus tenían una correlación negativa con los niveles de lípidos en sangre. RDA indicó una fuerte correlación positiva entre la producción y la abundancia de metabolitos fecales y microbios intestinales en ratones hipercolesterolémicos que recibieron v/i/uH6.

a Análisis de correlación entre las 10 bacterias más ricas y los índices fisicoquímicos de hipercolesterolemia por el método de Spearman. b–d Análisis de redundancia (RDA) de la correlación entre la comunidad microbiana v/i/uH6 y los metabolitos fecales (vitaminas-cofactores, aminoácidos, ácidos biliares). Los datos se presentan como la media ± SEM (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. HCD_ND se refiere al grupo de ratones modelo de hipercolesterolemia; v/i/uH6 se refiere a células bacterianas viables (vH6), inactivadas por calor (iH6) y lisadas ultrasónicamente (uH6).

Lactobacillus plantarum H6 (CGMCC 18205) es una cepa probiótica con efecto hipocolesterolemiante que se ha aislado de la masa fermentada en nuestro laboratorio y se le ha concedido una patente de invención nacional (No. ZL 201910955071. X). Previamente, realizamos experimentos in vivo para evaluar el efecto preventivo de la Lp H6 sobre la hipercolesterolemia. El estudio actual evaluó aún más sus efectos terapéuticos sobre la hipercolesterolemia. Las células H6 muertas y lisadas también se evaluaron juntas para obtener una comprensión más completa de los efectos reguladores de H6 en el metabolismo de los lípidos.

Los ratones hipercolesterolémicos que recibieron H6 viable e inactivado aumentaron su ingesta de alimentos, pero no tuvieron cambios significativos en el aumento de peso. Este hallazgo es consistente con un estudio previo que encontró que Lactobacillus fermentum ZJUIDS06 y Lactobacillus plantarum ZY08 no tuvieron efecto sobre la pérdida de peso en ratas hipercolesterolémicas15. Sin embargo, v/i/uH6 disminuyó significativamente el peso del hígado, al igual que las heces del intestino de los ratones tratados con vH6 (FMT3), lo que implica que v/i/uH6 podría mejorar la función microbiana intestinal y, por lo tanto, mejorar el metabolismo de los lípidos y el gasto de energía.

En la práctica clínica, los niveles de CT, TG, LDL-C, ALT y AST en el organismo son críticos para el control de la salud16,17. En este estudio, la cepa H6, incluidas las células vivas y muertas, tuvo buenos efectos hipolipemiantes, lo que fue confirmado por indicadores bioquímicos en el suero y el hígado, así como por pruebas de histopatología. En general, la viabilidad celular es un requisito importante para que los probióticos realicen sus funciones de promoción de la salud16. Sin embargo, los posbióticos, que son células bacterianas no viables, fracciones bacterianas o lisados celulares, también podrían brindar ventajas fisiológicas al huésped al ofrecer bioactividad adicional6. Nuestros resultados mostraron que las células H6 muertas por calor y lisadas por ultrasonido aún mantienen cierta actividad fisiológica hasta cierto punto, lo que puede deberse a la capacidad de los componentes de la pared celular para absorber el colesterol. Se ha demostrado que el colesterol se une al peptidoglicano de la pared celular, que contiene aminoácidos con capacidad de unión, pero los mecanismos exactos aún se desconocen6. Además, también se ha demostrado que el exopolisacárido mejora el metabolismo de los lípidos. Cambia la homeostasis del colesterol a través de la síntesis y combinación de colesterol y ácidos biliares, y el mecanismo específico aún necesita ser explorado18.

Se ha demostrado que la proteína 1 de desacoplamiento hepático (UCP1) regula el succinato extracelular y la inflamación en el hígado al aumentar el gasto de energía y reducir los lípidos hepáticos19. En este estudio, UCP1 aumentó en el hígado de ratones que recibieron v/i/uH6 y FMT3, lo que indica que la cepa H6 inhibe la degeneración hepática en ratones hipercolesterolémicos al mejorar la termogénesis y el metabolismo de los lípidos. En términos del metabolismo de los glucolípidos, tanto el H6 viable como el muerto mejoraron la tolerancia a la insulina, mientras que el H6 lisado mejoró la tolerancia a la glucosa en ratones. Estos hallazgos son consistentes con hallazgos previos que encontraron que las bifidobacterias esterilizadas podrían mejorar la tolerancia a la glucosa y la resistencia a la insulina y, por lo tanto, reducir los niveles de glucosa en sangre en ratones con trastornos del metabolismo de carbohidratos y lípidos20. Cabe destacar que FMT3 usando heces de ratones a los que se les administró H6 viable tiene los mismos beneficios fisiológicos que las cepas viables, como reducir los lípidos y mejorar el metabolismo de los glucolípidos, lo que implica que el H6 viable indujo la producción de metabolitos beneficiosos por parte de los microorganismos intestinales en ratones21.

Se ha reconocido que los suplementos de probióticos provocan cambios evidentes en la composición microbiana intestinal y, por lo tanto, regulan el metabolismo de las grasas de la dieta22. Por lo tanto, se han aislado e identificado microorganismos intestinales relevantes para la salud del huésped. Actualmente se está reconociendo el papel de los microorganismos intestinales en la salud o la enfermedad23.

En este estudio, tanto v/i/uH6 como FMT3 fueron suficientes para mejorar la composición microbiana en el intestino inducida por una dieta rica en colesterol. Lactobacillus y Coriobacteriaceae_UCG-002 se enriquecieron en ratones que recibieron vH6, lo que es consistente con los hallazgos previos en nuestro laboratorio14. Se encontró que Lactobacillus era una bacteria beneficiosa común con la capacidad de regular el metabolismo del colesterol debido a su alta actividad hidrolasa de sales biliares24,25. Se encontraron cuatro géneros dominantes en ratones que recibieron v/i/uH6, incluidos norank_f__Oscillospiraceae, Muribaculu, unclassified_o__Bacteroidales y Ruminococcus, entre los cuales, Ruminococcus se encontró enriquecido en el tracto intestinal de niños con peso normal, mientras que se detectaron menos Oscillospiraceae en individuos obesos. , lo que sugiere que estos dos géneros se correlacionaron negativamente con la reducción del colesterol26. Tanto uH6 como FMT3 aumentaron norank_f__Muribaculaceae, una bacteria antiinflamatoria bien definida.

Muribaculaceae recibió su nombre del análisis y descripción de los problemas y características de la familia S24-7 de bacterias en términos de diversidad, ecología, potencial funcional y presencia en la línea germinal27. Es funcionalmente diferente de su familia vecina y multifuncional con respecto a la degradación de carbohidratos complejos y alto contenido calórico28. Los estudios han demostrado que la comunidad de Muribaculaceae en la flora intestinal de ratones con dieta rica en grasas se reduce significativamente29. Muribaculacea es la bacteria más abundante en el intestino a nivel de género en nuestro estudio, en relación con los ratones alimentados con una dieta alta en colesterol, Muribaculacea fue notablemente más alta en ratones con i/uH6 o FMT3, lo que indica que puede tener un papel importante en el metabolismo de los lípidos. Además, FMT3 también aumentó unclassified_f__Ruminococcaceae, unclassified_c__Bacilli e Intestinimonas. Se informó que Intestinimonas controla el peso corporal y previene la diabetes tipo II en un estudio de cohorte de muestras de salud y enfermedades metabólicas30. Allobaculum y Turicibacter fueron géneros que podrían inducir inflamación y obesidad26,31. Se encontró que Allobaculum y Faecalitalea eran más abundantes en ratones tratados con proteínas de cerdo y manteca de cerdo, lo que sugiere que estos géneros se correlacionaron positivamente con la inflamación32. Similar a estos hallazgos, encontramos que la abundancia de Faecalibaculum, Allobaculum y Turicibacter aumentó en ratones alimentados con dietas altas en colesterol, mientras que disminuyó en ratones que recibieron v/i/uH6. Aunque Bifidobacterium generalmente se reconoce como una bacteria beneficiosa33,34, se encontró que era menos abundante en ratones que recibieron v/i/uH6 o FMT3 en este estudio, y las razones de esto deben investigarse más a fondo.

Se sabe que muchos nutrientes desempeñan un papel en la regulación del metabolismo de los lípidos35,36. Una dieta rica en vitaminas puede reducir los riesgos de enfermedad coronaria y aterosclerosis, ya que se ha demostrado que las vitaminas del complejo B reducen los niveles de TC y TG en el cuerpo. La niacina, una vitamina del complejo B, se utiliza para tratar la enfermedad aterosclerótica en combinación con algunos fármacos hipolipemiantes37. El α-metil-l-triptófano podría mejorar la hiperglucemia, la resistencia a la insulina y la esteatosis hepática38, mientras que el ácido l-glutámico podría inhibir la progresión de la aterosclerosis y la enfermedad del hígado graso39. En este estudio, el tratamiento con v/i/uH6 incrementó los niveles de vitaminas-cofactores y aminoácidos relacionados con el metabolismo lipídico de la microbiota intestinal, explicando en parte el mecanismo de acción hipocolesterolemiante de la cepa Lp H6. Los ácidos biliares (BA) son importantes moléculas de señalización estrechamente relacionadas con el metabolismo del colesterol. Muchos estudios han demostrado que la biotransformación de BA primarios por parte de microorganismos intestinales puede reducir la acumulación de grasa en el hígado y reducir los niveles de lípidos en sangre40. Nuestro estudio anterior mostró que H6 podría ejercer efectivamente sus efectos reductores del colesterol a través de la hidrolasa de sales biliares, así como la adsorción de membrana, la coprecipitación y la inhibición de las micelas de colesterol. Además, al promover la expresión del gen CYP7A1 e inhibir la vía del receptor farnesoide X, el H6 viable podría aumentar la síntesis de BA y la abundancia de bacterias que contienen actividad hidrolasa de sales biliares (BSH)14. En este estudio, también descubrimos que a/i/sH6 y FMT3 redujeron los niveles relativos de BA primarios, lo que sugiere que H6 podría prevenir la absorción de BA en el intestino delgado. Los SCFA son otro metabolito importante de la microbiota intestinal, que se ha demostrado que desempeña un papel importante en la prevención y el tratamiento de muchas enfermedades41. Sin embargo, las cantidades de SCFA no cambiaron después del consumo de v/i/uH6 en este estudio, lo cual está de acuerdo con un ensayo doble ciego aleatorizado reciente que mostró que los voluntarios que consumieron un tipo de probiótico L. plantarum Dad-13 mejoraron efectivamente el perfil de lípidos. sin cambios significativos en la concentración de SCFA en el intestino42. La razón no es clara.

Se ha demostrado que Muribaculaceae tiene una correlación negativa con el peso corporal del ratón y los parámetros bioquímicos43, a partir de las observaciones registradas anteriormente, investigamos la correlación entre la microbiota intestinal y los parámetros fisicoquímicos mediante el análisis de correlación de Pearson y RDA, y descubrimos que estaban altamente correlacionados. Sin embargo, esta correlación debe validarse a nivel de tensión.

Este estudio investigó el efecto terapéutico de una nueva cepa patentada Lactobacillus plantarum H6 en diferentes estados (activo, inactivado por calor y lisado ultrasónicamente) en ratones hipercolesterolémicos. Como se muestra en la Fig. 7, las células v/i/uH6 y las heces de ratones tratados con vH6 (FMT3) mejoraron la hipercolesterolemia en ratones, y este efecto se atribuyó en parte a la regulación de la microbiota intestinal y los metabolitos relacionados con el metabolismo de los lípidos. Muribaculaceae podría emplearse como un biomarcador potencial para la reducción efectiva del colesterol. La Lp H6 inactivada por calor y lisada por ultrasonidos podría ser un posbiótico prometedor para regular el metabolismo del colesterol. Aunque la Lp H6 en los tres estados puede mejorar la hipercolesterolemia en ratones en diferentes grados, su mecanismo aún se desconoce, y las moléculas efectoras y las vías de señalización de la Lp H6 para reducir el colesterol aún merecen investigación en estudios futuros.

Las células v/i/uH6 podrían reducir TC, TG, LDL-C, ALT, AST en el suero y TC, TG en el hígado en varios niveles y mejorar los índices GTT e ITT. Además, se encontró la recuperación de estos índices bioquímicos y del microbioma intestinal después de FMT usando heces de ratones tratados con vH6. Se descubrió que Muribaculaceae es la más abundante en el intestino de los ratones después de los tratamientos v/i/uH6, lo que sugiere que podría usarse como un biomarcador potencial para reducir el colesterol de manera efectiva. Las células v/i/uH6 incrementaron el metabolismo de la flora intestinal de vitaminas-cofactores, así como de aminoácidos, al mismo tiempo que disminuyeron el contenido relativo de ácidos biliares primarios. El análisis de correlación de Pearson mostró que norank_f__Muribaculaceae y Lactobacillus tenían una correlación negativa con los niveles de lípidos en sangre. RDA indicó una fuerte correlación positiva entre la producción y la abundancia de metabolitos fecales y microbios intestinales en ratones hipercolesterolémicos que recibieron v/i/uH6. En general, las células v/i/uH6 fueron eficaces para mejorar la hipercolesterolemia en ratones, y este efecto se atribuyó en parte a la regulación de la microbiota intestinal y los metabolitos relacionados con el metabolismo de los lípidos. v/i/uH6 se refiere a células bacterianas viables (vH6), inactivadas por calor (iH6) y lisadas ultrasónicamente (uH6). (La figura fue creada con Biorender.com.).

La simvastatina se adquirió de Shandong Lu'an Anti-Pharmaceutical Group Saite Co., Ltd, Shandong, China. La inyección de insulina se compró a Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Group Co., Ltd. El medidor de glucosa en sangre y el papel de prueba de glucosa en sangre (tipo GA-3) se compraron a Sanno Biosensing Co., Ltd, Jiangsu, China. Los kits de detección de TC, TG, LDL-C, HDL-C, ALT y AST se compraron en el Instituto de Investigación de Bioingeniería de Jiancheng (Nanjing, China).

Lactobacillus plantarum H6 (CGMCC 18205) se seleccionó de la masa pegajosa, un producto tradicional chino de harina fermentada. Antes del experimento, las células bacterianas se activaron dos veces. Las células activadas se inocularon con medio MRS y se cultivaron en condiciones anaeróbicas a 37 °C durante 24 h. Después del cultivo, la suspensión bacteriana se lavó dos veces con solución salina fisiológica y la concentración de la suspensión se ajustó a 1 × 109 ufc/mL (vH6). Las células inactivadas (iH6) se prepararon a partir de una suspensión bacteriana en un baño de agua a 90 °C durante 30 min con cambios menores al enfoque anterior44. La suspensión bacteriana se trató con un pulverizador ultrasónico de células durante 5 s y 60 min a intervalos de 9 s para preparar un lisado ultrasónico bacteriano (uH6) con cambios menores al enfoque anterior45 y el cultivo en placa mostró que no crecían bacterias viables.

Se compraron 88 ratones macho C57BL/6 (5 semanas de edad y con un peso de 18 a 19 g) de Shenyang Changsheng Biotechnology Co., Ltd. (número de aprobación: SCXK (Liao) 2021-0001, Liaoning, China). Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la Universidad Agrícola de Jilin y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Agrícola de Jilin. Los ratones se mantuvieron a temperatura ambiente (25 ± 1 °C) en ciclos de 12 h de luz/12 h de oscuridad. Después de una semana de adaptación, los ratones se dividieron en 3 grupos, incluido el grupo de dieta normal (Beijing Co-operative Feeds Co., Ltd.) (ND), la dieta alta en colesterol (Highcolesterol Rat Food, Dietz Biotechnology Co., Ltd. ) (HCD), y el grupo de tratamiento.

Después de 4 semanas de alimentación, se extrajo el suero y el hígado de los ratones ND y HCD después de la eutanasia para medir los niveles de TC y TG. Cuando los niveles de lípidos del grupo HCD fueron 2-3 veces más altos que los del grupo ND, se consideró que el modelo de hipercolesterolemia fue exitoso y se usó en los siguientes experimentos. Desde la semana 5 hasta la semana 12, todos los grupos fueron alimentados con la dieta normal excepto el grupo HCD, mientras tanto, las células v/i/uH6 (1 × 109 ufc/mL) y Simvastatin (3,80 mg/kg BW) fueron alimentados diariamente por sonda, respectivamente. Los grupos ND y HCD recibieron alimentación forzada con NaCl al 0,9 % en la misma cantidad todos los días (el grupo HCD se alimentó con una dieta normal y se denominó grupo HCD_ND).

El diseño experimental de la prueba de trasplante de microbiota fecal (FMT) es el siguiente: en condiciones asépticas, se recolectaron 300 mg de heces frescas de los grupos HCD_ND, Sim y vH6 respectivamente todos los días, resuspendidas en 3 ml de NaCl estéril al 0,9 %. luego se centrifugó a 800 g por 3 min46. Luego, se recogió el sobrenadante y los ratones modelo de hipercolesterolemia (grupo HCD_ND) se usaron como receptores de la prueba FMT. El FMT que usa heces de los grupos HCD_ND, Sim y vH6 se denomina FMT1, FMT2 y FMT3, respectivamente, como se muestra en la Fig. 8. El día antes de matar a los ratones, las heces de los ratones se recolectaron en condiciones asépticas, congeladas en nitrógeno líquido. y se mantuvo a -80 °C. Después de 12 semanas de experimentos con animales, los ratones se anestesiaron con éter y se sacrificaron por separación del cuello. Se recogió sangre, se centrifugó a 3000 g min a 4ºC durante 15 °C para obtener suero, que se almacenó a -20 °C para su uso posterior. El hígado se recogió y pesó, una parte se fijó con paraformaldehído al 4% y otra parte se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C.

En las primeras 4 semanas, 88 ratones C57BL/6 macho se dividieron aleatoriamente en un grupo de dieta normal (ND) y un grupo de dieta con colesterol alto (HCD). Desde la semana 5 hasta la semana 12, todos los grupos recibieron la dieta normal excepto HCD, mientras tanto, células v/i/uH6 (1 × 109 ufc/ml) y simvastatina (3,80 mg/kg de peso corporal) se administraron por sonda todos los días. Los grupos ND y HCD fueron alimentados con NaCl al 0,9 % en la misma cantidad todos los días. Los ratones modelo de hipercolesterolemia se utilizaron como receptores de la prueba FMT. El FMT se llevó a cabo utilizando heces de ratones tratados con NaCl y vH6, respectivamente. (La figura fue creada por el autor. No se utilizaron materiales de terceros).

En la octava semana de tratamiento con v/i/uH6 y FMT3, los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche (para la prueba de tolerancia a la glucosa) o durante 4 h (para la prueba de tolerancia a la insulina) y se les inyectó por vía intraperitoneal glucosa (2 g/kg de peso corporal) o insulina. (0,75 U/kg de peso corporal), respectivamente. Se recogió sangre de la cola a los 0, 15, 30, 60 y 120 min después de la inyección, y se midió la glucosa en sangre mediante un glucómetro8 en sangre según las instrucciones del fabricante. Se calculó el valor AUC de cada grupo.

Los contenidos de TC, TG, HDL-C, LDL-C, AST y ALT en suero y TC, TG en hígado se determinaron con los kits de reactivos de Nanjing Jiancheng Biomedical Company.

Tinción HE: las secciones de parafina desparafinadas del hígado se tiñeron en una solución de tinción de hematoxilina durante 3 a 5 minutos, luego se lavaron con agua corriente. Después de eso, las secciones de tejido se deshidrataron en gradiente de alcohol al 85% y al 95% durante 5 min, se tiñeron en solución de tinción de eosina durante 5 min, se sellaron con gel neutro y se recolectaron imágenes de ×400 bajo un microscopio.

Tinción con aceite rojo O: se fijaron secciones de tejido fresco congelado y luego se tiñeron con aceite rojo O. Las secciones se retiraron, se dejaron durante 3 s y luego se sumergieron secuencialmente en dos tazas de isopropanol al 60 % durante 3 s y 5 s cada una. Luego, las secciones se volvieron a teñir con hematoxilina durante 3 a 5 minutos, se sellaron con sellador de gelatina de glicerol y se recolectaron imágenes de × 400 bajo un microscopio.

Análisis inmunohistoquímico: las secciones de tejido se desparafinaron para la reparación del antígeno, se colocaron en una solución de peróxido de hidrógeno al 3 % para bloquear la peroxidasa endógena, se sellaron a temperatura ambiente durante 30 min goteando BSA al 3 %, se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C y se incubaron con el anticuerpo secundario. anticuerpo durante 50 min a temperatura ambiente. Luego, la solución de color DAB recién preparada se goteó gota a gota y el tiempo cromogénico se controló bajo un microscopio. Los núcleos se volvieron a teñir con hematoxilina durante 3 minutos y se sellaron con gel neutro para obtener imágenes microscópicas con un aumento de ×400.

El ADN genómico de la comunidad microbiana se extrajo de muestras fecales utilizando el kit de ADN del suelo EZNA® (Omega Bio-tek, Norcross, GA, EE. UU.). La región hipervariable V3-V4 del gen 16S rRNA bacteriano se amplificó con los pares de cebadores 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') y 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'). El producto de la PCR se extrajo del gel de agarosa al 2 %, se purificó con el kit de extracción de gel de ADN AxyPrep (Axygen Biosciences, Union City, CA, EE. UU.) y se cuantificó con el fluorómetro Quantus™ (Promega, EE. UU.). Para la secuenciación se utilizó la plataforma Miseq PE300/NovaSeq PE250 de Illumina (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd). Se controló la calidad de las secuencias sin procesar utilizando el software fastp47 (https://github.com/OpenGene/fastp, versión 0.20.0) y el software FLASH48 (http://www.cbcb.umd.edu/software/flash, versión 1.2 .7) para empalmes. Usando el software UPARSE (http://drive5.com/uparse/, versión 7.1), las secuencias se agruparon en OTU y las quimeras se eliminaron en base al 97 % de similitud. Los datos se analizaron en la plataforma de computación en la nube Megisense (http://cloud.majorbio.com/).

Análisis de metabolómica no dirigida basado en cromatografía líquida de ultra rendimiento-espectrometría de masas de tiempo de vuelo en tándem (UPLC/Q-TOF-MS/MS; Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd). Se colocaron 50 mg de muestras fecales en 400 μL de solución de extracción (acetonitrilo: metanol = 1:1) para extracción y se llevaron 10 μL de sobrenadante a la máquina para su análisis. Las fases móviles consistieron en ácido fórmico al 0,1 % en agua (disolvente A) y ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo: isopropanol (1:1, v/v) (disolvente B). El gradiente de solvente cambió de acuerdo a las siguientes condiciones: de 0 a 3 min, 95% (A): 5% (B) a 80% (A): 20% (B), de 3 a 9 min, 80% (A ): 20% (B) a 5% (A): 95% (B), de 9 a 13 min, 5% (A): 95% (B) a 5% (A): 95% (B), de 13 a 13,1 min, 5% (A): 95% (B) a 95% (A): 5% (B), de 13,1 a 16 min, 95% (A): 5% (B) a 95% (A): 5% (B) para equilibrar los sistemas. El volumen de inyección de la muestra fue de 2 μL y la velocidad de flujo se fijó en 0,4 mL/min. La temperatura de la columna se mantuvo a 40 °C. Los datos espectrométricos de masas se recopilaron usando un espectrómetro de masas Thermo UHPLC-Q Exactive equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) que funciona en modo de iones positivos o negativos. Los espectros de masas de estas características metabólicas se identificaron utilizando la masa exacta, los espectros de fragmentos de MS/MS y la diferencia de proporción de isótopos mediante la búsqueda en bases de datos bioquímicas confiables como la base de datos del metaboloma humano (HMDB) (http://www.hmdb.ca/) y la base de datos de Metlin (https://metlin.scripps.edu/). Los datos preprocesados se analizaron en la plataforma de computación en la nube Megisense (http://cloud.majorbio.com/).

Se utilizó un cromatógrafo de gases Thermo TRACE1310-ISQ LT equipado con una columna capilar Agilent HP-INNOWAX para determinar los ácidos grasos de cadena corta, incluidos el ácido acético, el ácido propiónico, el ácido butírico, el ácido isobutírico, el ácido valérico, el ácido isovalérico y el ácido cáprico ( Suzhou Panomic Biopharmaceutical Technology Co., Ltd.). Brevemente, mezcle 50 mg de muestra fecal con 50 μL de ácido fosfórico al 15 %, 100 μL de 125 μg/mL de solución estándar interna (ácido isocaproico) y 400 μL de éter y centrifugue a 4 °C durante 10 min a 12 000 × g. Condiciones cromatográficas49: inyección dividida, volumen de inyección 1 μL, relación de división 10:1. La temperatura de la entrada de la muestra, la fuente de iones y la línea de transmisión fue de 250 °C, 300 °C y 250 °C, respectivamente. La temperatura de aceleración programada comenzó a 90 °C, luego aumentó hasta 120 °C a 10 °C/min, luego aumentó hasta 150 °C a 5 °C/min y finalmente aumentó hasta 250 °C a 25 °C/min durante 2 min. El gas portador fue helio con un caudal de 1,0 ml/min y una energía de electrones de 70 eV50. Los contenidos de SCFAs se calcularon de acuerdo con las curvas de calibración de cada estándar.

Los datos se analizaron estadísticamente y se graficaron utilizando Graphpad Prism 8.0, Majorbio Cloud Platform y Genes Cloud. La significación de las diferencias entre los dos grupos se analizó mediante la prueba t. Para las comparaciones entre 3 o más condiciones, se utilizó ANOVA unidireccional seguido de las pruebas de comparación múltiple de Dunnett o Tukey. Se realizó un análisis de correlación utilizando el análisis de Pearson. Los datos se presentan como medias ± (SD). P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces.

Los conjuntos de datos presentados en este estudio se pueden encontrar en repositorios en línea. Los nombres del repositorio/repositorios y los números de acceso se pueden encontrar a continuación: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA882947 para la secuenciación de 16S rRNA y http://www.ebi.ac. uk/metabolights/MTBLS5977, MTBLS5977 y http://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS5978, MTBLS5978 para metabolómica no dirigida y metabolómica dirigida. Los demás datos del estudio actual están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32172189) y el Programa Nacional de Capacitación en Innovación y Emprendimiento para Estudiantes Universitarios (202010193104).

Estos autores contribuyeron igualmente: Yue Li, Mengling Chen.

Facultad de Ciencias e Ingeniería de Alimentos, Universidad Agrícola de Jilin, 130118, Changchun, China

Yue Li, Mengling Chen, Yuxuan Ma, Yue Yang, Ying Cheng, Huijing Ma, Dayong Ren y Ping Chen

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RDY, CP y LY conceptualizado y diseñado los experimentos. LY procesó, analizó e interpretó los datos de la secuencia del gen 16S rRNA y los datos de metabolómica. LY, CML, MYX, YY, CY y MHJ realizaron experimentos y analizaron datos. RDY y LY escribieron el artículo con contribuciones de todos los autores. Todos los autores discutieron los resultados y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Dayong Ren o Ping Chen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Li, Y., Chen, M., Ma, Y. et al. Regulación del probiótico viable/inactivado/lisado Lactobacillus plantarum H6 sobre la microbiota intestinal y sus metabolitos en ratones hipercolesterolémicos. npj Sci Food 6, 50 (2022). https://doi.org/10.1038/s41538-022-00167-x

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Recibido: 04 mayo 2022

Aceptado: 11 de octubre de 2022

Publicado: 31 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41538-022-00167-x

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