Característica estructural del polisacárido aislado de Nostoc commune, y su potencial como actividad antidiabética y captadora de radicales - Grupo Co., Ltd de los laboratorios de minería de Foshan

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 22155 (2022) Citar este artículo

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En este documento, el polisacárido crudo de Nostoc commune se extrajo por métodos de calentamiento y asistidos por ultrasonidos por separado, los polisacáridos homogéneos HNCP3 y UNCP4 se obtuvieron después de purificarlos mediante cromatografía en columna de celulosa DEAE-52 y cromatografía en columna de gel Sephacryl G-100. Las estructuras de HNCP3 y UNCP4 se caracterizaron mediante determinación del peso molecular, espectroscopia infrarroja, detección DSC, oxidación de peryodato de sodio, reacción de degradación de Smith y análisis de metilación. La conformación de la solución fue estudiada por SEM y AFM. Los resultados mostraron que la extracción asistida por ultrasonidos tuvo efectos sobre el peso molecular, la composición de monosacáridos, la relación molar y la configuración de Nostoc commune. La cadena principal de HNCP3 y UNCP4 era → 6)-D-Glcp(1→ y → 2, 6)-D-Glcp, pero UNCP4 contenía ramas 1, 2, 6-galactosa y 2, 3-Me2-D-Ara , mientras que HNCP3 no lo hizo. Los resultados de la composición de monosacáridos indicaron que la manosa se presentó tanto en HNCP3 como en UNCP4. SEM y AFM mostraron que la estructura de UNCP4 era helicoidal y que las conformaciones de solución de HNCP3 y UNCP4 eran diferentes en diferentes entornos de solución. Los estudios sobre la capacidad de eliminación de radicales DPPH, aniones superóxido y radicales hidroxilo mostraron que UNCP4 tenía una mayor actividad antioxidante, mientras que los estudios sobre las actividades antidiabéticas mostraron que el efecto hipoglucemiante de UNCP4 era más fuerte que el de HNCP3. Por lo tanto, la extracción asistida por ultrasonidos (UAE) aumenta la bioactividad del polisacárido común de Nostoc (NCP), así como la tasa de extracción.

Nostoc commune es una especie de alga verde-azulada heterocística inferior capaz de formar una capa gelatinosa extendida compuesta de polisacáridos, que crece vigorosamente en regiones montañosas áridas, secas y frías1,2. Nostoc commune es rico en proteínas, polisacáridos, aminoácidos, lípidos y una variedad de vitaminas y elementos metálicos, con un rico valor nutricional. Muchos informes han demostrado que diferentes especies de Nostoc contienen una variedad de compuestos medicinales únicos (aminoácidos, ácidos grasos, polisacáridos, sustancias antimicrobianas) que presentan buenas bioactividades, como la fijación de nitrógeno3, la reducción del riesgo de enfermedad coronaria4, la antioxidación5, la anti- microbico6, suprimiendo el crecimiento de células Jurkat linfoides T humanas7, antitumoral8, etc. funciones fisiológicas como la antiinfección10, la disminución de los niveles de lípidos en la sangre11, la activación de la autofagia mediante la regulación negativa de la vía PI3K/AKT/mTOR12, antimicrobiano y antiinflamatorio13, etc. Por lo tanto, N. commune, comúnmente conocida como ''ishikurage'', tiene anteriormente se ha utilizado como ingrediente alimentario o medicina popular para la prevención y cura de enfermedades en el sudeste asiático14.

Se ha señalado que los polisacáridos de N. commune juegan un papel importante en resistir la desecación extrema, restaurar fácilmente la actividad metabólica y tener nuevas bioactividades tras la rehidratación, y estas funciones exhiben una relación estructura-actividad15,16,17,18,19,20. Es bien sabido que el método de extracción tiene un efecto significativo sobre el rendimiento, las características estructurales y las actividades biológicas de los polisacáridos21,22. La extracción convencional por reflujo térmico (HRE) es el método más utilizado para extraer polisacáridos. Generalmente, el rendimiento de este proceso depende en gran medida del tiempo y la temperatura de extracción15,23. Sin embargo, la temperatura de extracción más alta y el tiempo de extracción más prolongado pueden provocar la degradación de los polisacáridos y la reducción de las actividades farmacológicas24. Por lo tanto, se han empleado varias técnicas nuevas para extraer polisacáridos para aumentar la tasa de extracción25, como la extracción asistida por ultrasonidos (UAE)26,27,28 y la extracción asistida por microondas (MAE). Sin embargo, se han realizado pocas investigaciones sobre la comparación de propiedades físicas, características estructurales y bioactividades entre los polisacáridos obtenidos por HRE y UAE. La tecnología de extracción asistida por ultrasonido se ha utilizado para obtener los polisacáridos crudos de la comuna de Nostoc en un estudio previo20. En este estudio, se utilizó la tecnología convencional de extracción por reflujo calentado, extracción asistida por ultrasonidos y precipitación con alcohol para preparar los polisacáridos crudos (NCP) de N. commune que se recolectaron en un área fría y húmeda a una altitud de aproximadamente 2000 m (condado de Weiyuan, Provincia de Gansu, China), y luego se estudiaron las propiedades fisicoquímicas, características estructurales y bioactividades de los segmentos purificados por cromatografía para evaluar las relaciones estructura-actividad.

Se cargaron 10 mg/mL de HNCP3 y UNCP4 en la columna cromatográfica DEAE-52 respectivamente y se eluyeron con una solución de NaCl en el rango de 0–1,0 mol/L. La elución con 0.3 mol/L de NaCl fue colectada y trazada por el método del ácido fenolsulfúrico, se obtuvieron dos picos con las recuperaciones de 29.34% y 34.28%. Después de la diálisis y la liofilización, la muestra se purificó aún más mediante la columna de cromatografía Sephadex G 100, se obtuvieron dos picos simétricos estrechos únicos denominados HNCP3 y UNCP4 (Fig. 1A, B) con tasas de recuperación del 80,9 % y 86,4 %, que indicaron HNCP3 y UNCP4 podría ser un polisacárido de componentes homogéneos29. Por lo tanto, UAE fue una técnica más eficiente para obtener un mayor rendimiento de polisacáridos de N. commune que HRE, y tiene más moléculas con propiedades físicas y químicas similares debido a los efectos de cavitación, mecánicos y térmicos de forma sintética30.

Perfiles de elución y distribuciones de pesos moleculares de HNCP3 y UNCP4 purificados por columna de celulosa DEAE-52 y columna Sephadex G-100. (A): la curva de elución de HNCP3 purificada por Sephadex G100; (B): la curva de elución de UNCP4 purificada por Sephadex G100; (C): distribuciones de peso molecular de HNCP3 por cromatografía líquida de alta resolución junto con determinación de dispersión de luz láser multiángulo; (D): distribuciones de peso molecular de UNCP4 por cromatografía líquida de alto rendimiento junto con determinación de dispersión de luz láser multiángulo.

Los pesos moleculares promedio de HNCP3 y UNCP4 se evaluaron mediante la técnica HPSEC-MALLS-RID como se muestra en la Tabla 1 y la Fig. 1C,D. Todas las muestras de HNCP3 y UNCP4 exhibieron estructuras de composición similares con diferentes distribuciones de peso molecular, lo que indica que HNCP3 y UNCP4 eran heteropolisacáridos. Los Mw más altos de HNCP3 y UNCP4 fueron 48,6 kDa y 14,54 kDa, respectivamente, mientras que los Mn más bajos fueron 22,72 kDa y 44,32 kDa, respectivamente. Como se muestra en la Tabla 1, el peso molecular promedio de UNCP4 fue menor que el de HNCP3, y la distribución de bajo peso molecular de UNCP4 (68,57 %) fue mayor que la de HNCP3 (46,18 %), lo que sugiere que el método UAE podría producir una mayor cantidad de fracciones de bajo Mw que el método tradicional HRE31. Esto podría atribuirse a que los polisacáridos fueron degradados por ultrasonidos hasta cierto punto, y una parte de las fracciones de alto Mw se convirtieron en fracciones de bajo Mw, aumentando así las cantidades de las fracciones de bajo Mw. El mismo fenómeno también se observó en el informe anterior29.

Las composiciones de monosacáridos de las muestras se determinaron mediante GC-MS y los resultados se presentaron en la Fig. 2. HNCP3 y UNCP4 se analizaron haciendo coincidir sus tiempos de retención con los de los monosacáridos estándar (Fig. 2A), lo que indica que los dos polisacáridos tenían diferentes composiciones de monosacáridos. HNCP3 estaba compuesto por ramnosa, manosa, glucosa, galactosa en una relación molar de 0,65: 0,55: 2,91: 2,73 y UNCP4 estaba compuesto por manosa, arabinosa, glucosa en una relación molar de 0,30: 6,84: 2,81. Los resultados ilustraron que tanto HNCP3 como UNCP4 estaban enriquecidos en glucosa, lo que indica que la glucosa era el monosacárido predominante. S. Jensen informó que la composición de monosacáridos de Nc-5-s purificada a partir de un extracto alcalino de N. commune fue Glc, GlcA, Xyl, Man, Ara, Rib, Gal en una proporción de 24:24:15:13:13 : 7: 4. Mientras que el monosacárido de un polisacárido soluble en agua (NSKP) purificado precipitando el extracto en agua caliente de Nostoc con 40 % (v/v) de etanol en agua caliente estaba compuesto de manosa, glucosa, xilosa, galactosa y glucurónico. ácido con una relación molar de 1,00: 1,92: 0,97: 1,02: 0,9132. Estos resultados demostraron que la diferencia en la composición de monosacáridos fue causada por los diferentes métodos de procesamiento y fuentes de material33.

Espectros GC-MS de la muestra de referencia. (A) HNCP3; (B) UNCP4; (C) PCNU; (D) El cromatograma de iones totales del análisis de metilación de HNCP por GC-MS; (E) El cromatograma de iones totales del análisis de metilación de UNCP por GC-MS; (F) El cromatograma de iones totales del producto metilado de HNCP3; (G) El cromatograma de iones totales del producto metilado de UNCP4.

De acuerdo con los resultados de la reacción de oxidación del peryodato, los consumos de peryodato de sodio de HNCP3 y UNCP4 fueron 0,61 mol y 0,93 mol, y las cantidades totales de ácido fórmico producido se calcularon en 0,43 mol y 0,65 mol. Las relaciones molares del consumo de ácido peryodato a la producción de ácido fórmico fueron 1,42 y 1,43, respectivamente, lo que indica que HNCP3 y UNCP4 podrían contener enlaces glucosídicos de 1 → 2, 1 → 2, 6, 1 → 3, 1 → 3, 6, etc. El GC de la degradación de Smith de HNCP3 se presentó en la Fig. 2D. La detección de glicerol sugirió que HNCP3 puede contener 1→ , 1→ 2, 1 → 6 y 1 → 2,6 enlace glucosídico. La detección de eritritol demostró que existía el tipo de enlace de la formación de eritritol, a saber, 1 → 4 y 1 → 4, 6-hexosa. Mientras tanto, la detección de ramnosa, manosa, glucosa y galactosa reveló que los polímeros pueden estar unidos por cuatro tipos de monosacáridos con 1 → 3, 1 → 2, 3, 1 → 3, 4, 1 → 3, 6 y 1 → 2, 3, 4 enlaces glucosídicos. El GC de la degradación de Smith de UNCP4 se presentó en la Fig. 2E, la formación de eritritol indicó la posible presencia de 1 → 4 y 1 → 4, 6 enlaces hexosas. La detección de manosa y glucosa y el aumento del contenido de glucosa en comparación con las muestras sin oxidación con peryodato mostró que la mayor parte de UNCP4 no se oxidaba con peryodato, y el polímero se vinculaba principalmente con 1 → 3 o 1 → 2,3 o 1 → 2, 4 o 1 → 3, 4 o 1 → 3, 6 o 1 → 2, 3, 6 o 1 → 2,4,6 o 1 → 3, 4, 6 enlaces glucosídicos. Se llevó a cabo un análisis de metilación para determinar los enlaces entre monosacáridos en HNCP3 y UNCP4 por GC/MS (Fig. 2F,G), y los detalles del enlace se muestran en la Tabla 2. Los resultados demostraron que los productos metilados de HNCP3 eran un total de seis liberaciones. de 2, 4, 6-Me3-Glcp [pico 1: → 3)-Glcp-(1 →], 2, 3, 6-Me3-Glcp [pico 2: → 4)-Glcp-(1 →], 3 , 4, 6-Me3-Galp [pico 3: → 2-Galp-(1 →], 2, 4-Me2-Galp [pico 4: → 2, 6)-Galp-(1 →], 2, 3, 4-Me3-Glcp [pico 5: → 6)-Glcp-(1 →], 2, 3, 4-Me3-Galp [pico 6: → 6)-Galp-(1 →] en una relación molar relativa de 1 : 1.34: 1.28: 1.98: 3.32: 3.12 (Tabla 2). No se detectó ramnosa debido a la menor proporción molar en este polisacárido. La siguiente unidad repetitiva de HNCP3 se dedujo como sigue:

El producto metilado de UNCP4 estaba compuesto por 2, 4-Me2-Rhap [pico 1: → 3)-Rhap-(1→], 2, 3-Met-Glcp [pico 2: → 4, 6)-Glcp- (1 →], 2, 3, 4-Me3-Glcp [pico 3: → 6)-Glcp-(1 →], 2, 3, 4, 6-Me4-Glcp [pico 4: → 4)-Glcp- (1 →], , 3, 6-Men-Glcp [pico 5: → 3)-Glcp-(1 →], 2, 4-Me2-Glcp [pico 6: → 3, 6)-Glcp-(1 → ] en una relación molar relativa de 1: 24.63: 36.13: 41.32: 9.87: 17.78 (Cuadro 2).Los resultados revelaron que la presencia de la siguiente unidad repetitiva en la UNCP4.

En la actualidad, se ha informado que una variedad de polisacáridos de plantas tienen actividades antioxidantes, incluidas las algas verdes, las algas pardas y las algas rojas y otros polisacáridos de algas35,36,37. Se ha informado que la mayoría de los polisacáridos con actividades biológicas destacadas están unidos por enlaces glucosídicos (1 → 3), que tienen una estructura de β–(1 → 3)-D-glucano con algunas cadenas laterales38,39. Sin embargo, la estructura y la configuración estereoscópica de los polisacáridos vegetales son muy complejas y su relación estructura-función aún debe estudiarse más a fondo. Se informó que un hongo comestible (Calocybe indica) posee actividad inmunoestimuladora y el esqueleto estructural primario tiene la misma unidad de glucósido α-D-Glcp-(1 → 4) que HNCP3 y UNCP440. El polisacárido de hojas de Toona sinensis tiene buenos efectos antioxidantes y otros efectos protectores contra la lesión hepática aguda en ratones41. Donde, la cadena principal del polisacárido TSP-1 de hojas de Toona sinensis tiene la misma unidad glucosídica α-D-Manp-(1 → 6) que HNCP3 y la misma unidad glucosídica α-D-Glcp-(1 → 6) que UNCP4. Mientras que la cadena ramificada tiene la misma unidad glucosídica α-D-Glcp-(1 →) que HNCP3 y la misma unidad glucosídica α-D-Manp-(1 → 3) que UNCP4. La detección de la estructura primaria del polisacárido comuna de Nostoc demostró que su cadena principal de polisacárido tiene α-D-Glcp-(1 → 4), α-D-Manp-(1 → 6) o α-D-Glcp-(1 → 6) glucósido, mientras que la cadena lateral tiene glucósido α-D-Glcp-(1 →) o α-D-Manp-(1 → 3), por lo que se especuló que tenía actividad antioxidante potencial. En una palabra, estos resultados de metilato fueron consistentes con las observaciones de oxidación de peryodato y degradación de Smith de HNCP3 y UNCP4.

No se pudieron observar diferencias visibles entre los espectros de HNCP3 y UNCP4 como se muestra en la Fig. 3A,B, lo que indica que HNCP3 y UNCP4 extraídos por los diferentes métodos tenían grupos funcionales similares. En detalle, las absorciones fueron muy obvias a 3400 cm−1 y 1100 cm−1, que fueron causadas por el estiramiento y la vibración angular del enlace O–H42. La absorción a 3423,085 cm−1 se atribuyó a la vibración de estiramiento CH. Un pico de estiramiento asimétrico a 1637 cm−1 y un pico de absorción aproximadamente a 1412 cm−1 fueron los indicadores de la presencia de vibración de estiramiento de grupos carbonilo y carboxilo43,44. Los dos picos de absorción en 1064,531 cm−1 y 1062,603 cm−1 correspondieron a las vibraciones de estiramiento de C–O–C o C–O–H de un anillo de piranosa, lo que confirma que HNCP3 y UNCP4 contenían azúcar de piranosa45. El pico medio a 590 cm-1 y el pico débil a 586 cm-1 se asociaron con la presencia de enlaces glucosídicos α y β, respectivamente.

Espectros FT-IR de HNCP3 (A) y UNCP4 (B). (NCP son polisacáridos Nostoc commune). DSC detecta HNCP3 (C) y UNCP4 (D).

Se utilizó el espectro termogravimétrico (TG) para determinar la pérdida de peso de HNCP3 y UNCP4 al calentar de 25 a 300 °C. Como se muestra en la Fig. 3C,D, los resultados revelaron una pérdida de peso de una etapa correspondiente a la pérdida de agua alrededor de 25–248 °C. La curva mostró que UNCP4 no se descompuso antes de 248 °C con una pérdida de peso relativamente suave de 10,97 % a 71,97 °C, mientras que HNCP4 comenzó a descomponerse a 216 °C con una pérdida de peso más rápida de 13,35 % a 90,09 °C. Se ha informado46 que el agua se formó por condensación intramolecular e intermolecular de hidroxilos de polímeros, y la descomposición del polímero se produjo a temperaturas inferiores a 300 °C. La tasa de pérdida de peso de UNCP4 fue más baja que la de HNCP3, lo que indica que UNCP4 podría tener una buena estabilidad térmica o tener texturas rugosas y superficies gruesas no consolidadas47.

Se aplicó calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar los cambios exotérmicos o endotérmicos con el aumento de temperatura de HNCP3 y UNCP4 (Fig. 3C, D). En el cual, los tres puntos clave de temperatura involucrados en el cambio de energía se marcaron como T0 (temperatura inicial), Tp (temperatura intermedia) y Tc (temperatura final). Ambos polisacáridos exhibieron porciones amorfas. Las temperaturas de transición vítrea de HNCP3, UNCP4 ocurrieron a 61,2 °C y 62,8 °C sin picos de fusión. Las transiciones endotérmicas continuas (amplias) se observaron como indicativas de pérdida de humedad en HNCP3 y UNCP4. La Figura 3C muestra que el valor de cambio de entalpía de HNCP3 fue -211,6 J/g y el pico exotérmico fue relativamente suave con una temperatura que excedía los 249,9 °C, y la reacción de pirólisis transcurrió relativamente sin problemas. Sin embargo, el valor de cambio de entalpía de HNCP3 fue - 226,1 J/g y se produjo un pico exotérmico pronunciado a una temperatura superior a 248,4 °C y la reacción de pirólisis avanzó más vigorosamente (Fig. 3D). En una palabra, hubo una pequeña diferencia entre ambos polisacáridos por el análisis de las curvas DSC.

Diferentes métodos de extracción podrían afectar las microestructuras de los polisacáridos48,49, la morfología y las estructuras de HNCP3 y UNCP4 fueron observadas por SEM y AFM (Fig. 4) en este artículo. A una resolución de 100 μm, la superficie de HNCP3 era lisa e irregularmente dentada con una conexión filamentosa y en forma de lámina (Fig. 4A), y UNCP4 exhibió la superficie más lisa y uniforme con la pronunciada estructura de vacíos helicoidales y en forma de panal ( Fig. 4B), que indicó que los cambios entre los dos polisacáridos podrían deberse al largo tiempo de calentamiento, la alta temperatura y el efecto de cavitación causado por la vibración ultrasónica. Estos resultados fueron similares a los resultados informados anteriormente de que los EAU tenían un efecto más drástico en la microestructura de los polisacáridos50.

Micrografías electrónicas de barrido de la comuna de Nostoc: imágenes SEM de HNCP3 y UNCP4 obtenidas por el microscopio JSM-7001E en la barra de escala de 100 p. m (A) y 10 p. m (B); (C, D) Micrografías de fuerza atómica de HNCP3 y UNCP4 obtenidas en modo tapping utilizando un instrumento Multimode 8 (Bruker, EE. UU.).

Para seguir observando las estructuras finas de HNCP3 y UNCP4, se utilizó el AFM para la observación morfológica. Como se muestra en la Fig. 4C, D, las moléculas HNCP3 y UNCP4 eran elipsoidales. Las moléculas de UNCP4 estaban sueltas y uniformes en tamaño y forma, y la longitud horizontal de las moléculas era de 226,56 nm con una altura vertical de 7,126 nm. En comparación con UNCP4, las moléculas HNCP3 mostraron diferentes tamaños y formas con una gran cantidad de micelas esféricas y una pequeña cantidad de dispersión, y la longitud horizontal de las moléculas fue de 101,56 nm con una altura vertical de 13,961 nm. De acuerdo con los resultados anteriores, podríamos especular que la agregación molecular existió en UNCP4, y sus unidades estructurales podrían ramificarse y enredarse entre sí. El análisis SEM y AFM proporcionó pruebas sólidas de la eficiencia mejorada de la extracción de polisacáridos por parte de los EAU.

Se han informado varios mecanismos de antioxidación que incluyen la supresión de la iniciación de la cadena, la quelación de iones metálicos, la descomposición de peróxidos y la eliminación de radicales51,52. Sin embargo, el mecanismo de acción de las actividades antioxidantes de HNCP3 y UNCP4 seguía sin estar claro. Las actividades antioxidantes de HNCP3 y UNCP4 se estimaron y se presentaron en la Fig. 5, donde las tasas de limpieza de radicales libres aumentaron gradualmente con el aumento de las concentraciones de las muestras. La figura 5A mostró las actividades depuradoras de HNCP3 y UNCP4 en el radical DPPH· en comparación con Vc. Entre todas las muestras, la solución de control positivo Vc tuvo la mayor tasa de aclaramiento, alcanzando el máximo de 95,41 % a la concentración de 0,2 mg/mL. UNCP4 también exhibió una capacidad de eliminación relativamente más fuerte (52,72 %) que HNCP3 (40,21 %) a la concentración de 1,0 mg/mL. Los resultados de la eliminación de radicales de anión superóxido por HNCP3 y UNCP4 se muestran en la Fig. 5B. La capacidad de eliminación aumentó significativamente con el aumento de la concentración de 0,2 a 1,0 mg/mL, y las tasas máximas de eliminación de HNCP3 y UNCP4 a 1,0 mg/mL fueron 30,12 % y 26,02 %, respectivamente. La figura 5C mostró los efectos de HNCP3 y UNCP4 sobre el depurador ·OH, con las tasas de eliminación más altas alcanzando el 22,71 % y el 26,70 % respectivamente, que fueron significativamente más bajas que el efecto depurador de Vc sobre los radicales hidroxilo. Estudios previos han informado que el efecto secuestrante del polisacárido crudo (HRSA) de N. commune en HO·podría alcanzar el 92,71% con la concentración de 10 mg/mL53. Los mecanismos de la acción antioxidante de HNCP3 y UNCP4 podrían ser la capacidad de la molécula para suministrar átomos de hidrógeno a los radicales libres, terminando así las reacciones en cadena de radicales libres y convirtiendo los radicales libres en productos no dañinos15,54. En este artículo, HNCP3 y UNCP4 mostraron diferentes actividades antioxidantes, que se atribuyeron a sus proporciones de composición de monosacáridos y enlaces de cadena lateral. Además, la onda ultrasónica podría degradar apropiadamente los polisacáridos de alto peso molecular y cambiar sus actividades antioxidantes55.

Actividades antioxidantes de HNCP3, UNCP4 y vitamina C (Vc). Nota: (A) Efecto de diferentes concentraciones de muestras en las actividades de eliminación de radicales DPPH; (B) Efecto de diferentes concentraciones de muestras en la eliminación de radicales hidroxilo; (C) Efecto de diferentes concentraciones de muestras en la eliminación del anión superóxido.

Se ha informado que las propiedades físicas como el peso molecular, la solubilidad y la viscosidad de los polisacáridos, así como el método de extracción de los polisacáridos, podrían afectar el efecto antioxidante de los polisacáridos vegetales56. Yang et al. encontraron que la extracción con agua caliente y la extracción asistida por ultrasonido de los polisacáridos de Pleurotus citrinopileatus tenían una mayor capacidad de captación de radicales libres en comparación con la extracción con álcali57. Además, Ni et al. estudió la composición de monosacáridos de ocho polisacáridos vegetales y su actividad depuradora de DPPH. Los resultados mostraron que la capacidad de eliminación de radicales DPPH de los ocho polisacáridos no estaba relacionada con el contenido de polisacáridos sino con la microestructura, y la forma específica y la intensidad del efecto de la composición de monosacáridos en la actividad antioxidante de los polisacáridos deben investigarse más58. En este estudio, cuando la concentración de polisacáridos extraídos por dos tipos de métodos de extracción fue de 1 mg/mL, el efecto antioxidante de UNCP4 fue ligeramente más fuerte que el de HNCP3, pero no significativamente.

HNCP3 y UNCP4 podrían inhibir las actividades de α-amilasa y α-glucosidasa, que estaban involucradas en el metabolismo de la glucosa al reducir la escisión de los enlaces glucosídicos de carbohidratos y liberar glucosa. Como se muestra en la Fig. 6A, la tasa de inhibición de la acarbosa sobre la α-glucosidasa alcanzó el máximo de 86,42 ± 1,59 % cuando la concentración de las muestras fue de 3,0 mg/ml, y las tasas de inhibición más altas de HNCP3 y UNCP4 también se obtuvieron con el valor de 60,03 ± 1,58% y 79,01 ± 1,41%, respectivamente. Mientras tanto, las actividades inhibitorias de HNCP3 y UNCP4 sobre la α-glucosidasa se mostraron en la Fig. 6B, donde la relación de inhibición presentó la relación dosis-dependiente. Las tasas de inhibición más altas de HNCP3 y UNCP4 en α-amilasa fueron 57,76 ± 1,88 % y 77,72 ± 2,03 %, respectivamente. Los resultados mostraron que HNCP3 y UNCP4 podrían prevenir el metabolismo de los carbohidratos en los alimentos y reducir efectivamente los niveles de glucosa en sangre posprandiales en el cuerpo59.

Tasas de inhibición de α-amilasa y α-glucosidasa por HNCP3 y UNCP4.

De hecho, se ha encontrado que muchos extractos de plantas y frutas poseen efectos inhibitorios sobre la α-glucosidasa con efectos secundarios mínimos60. Aunque HNCP3 y UNCP4 tuvieron efectos inhibitorios más bajos que el fármaco acarbosa, los resultados indicaron que podrían ser inhibidores potenciales de la α-glucosidasa. En este estudio, la diferencia en las actividades inhibitorias de HNCP3 y UNCP4 podría deberse a que la extracción asistida por ultrasonido podría extraer y/o conservar más compuestos bioactivos con actividad antihiperglucemiante en poco tiempo en condiciones de temperatura media61.

Nostoc commune es rico en proteínas, calcio, fósforo, hierro y otros nutrientes, y se ha utilizado como ingrediente durante mucho tiempo para el consumo humano, con el efecto de reducir la grasa, aclarar el calor y dar brillo a los ojos, etc. La actividad biológica de polisacárido, el ingrediente activo importante en Nostoc commune, no está claro. En los últimos años, con el vigoroso desarrollo de los antioxidantes, se ha desarrollado gradualmente desde un simple antioxidante sintético hasta un eliminador de radicales libres natural, ecológico, eficiente y de baja toxicidad in vivo obtenido a partir de productos naturales. La diabetes es una de las tres enfermedades más persistentes que amenazan la salud humana, con una tasa de mortalidad sólo superada por las enfermedades cardiovasculares y el cáncer. El desarrollo de fármacos terapéuticos para la diabetes ha sido un tema candente de investigación. Se ha encontrado que muchos tipos de polisacáridos tienen cierta actividad antidiabética en componentes de productos naturales. Por lo tanto, en este estudio, los polisacáridos de Nostoc commune extraídos mediante extracción con agua caliente y extracción asistida por ultrasonidos se purificaron y caracterizaron estructuralmente. Sus actividades antioxidantes y antidiabéticas también se investigaron de forma exploratoria. Los resultados mostraron que HNCP3 y UNCP4 tienen ciertas actividades de captación de radicales libres.

La α-amilasa y la α-glucosidasa son enzimas importantes en la digestión de los carbohidratos en los alimentos. Los inhibidores de la α-amilasa y los inhibidores de la α-glucosidasa pueden inhibir la actividad de la α-amilasa y la α-glucosidasa, ralentizar la conversión y absorción de glucosa, reducir el pico de glucosa en sangre posprandial y ajustar el nivel de glucosa en sangre, reduciendo así la estimulación de glucosa en sangre al páncreas, mejorando la sensibilidad de la insulina, protegiendo la función del páncreas y previniendo y mejorando eficazmente la aparición y el desarrollo de diabetes. En este estudio, se examinaron las actividades inhibitorias in vitro de los polisacáridos extraídos por ambos métodos contra la α-amilasa y la α-glucosidasa, y quedó claro que tanto HNCP3 como UNCP4 tienen ciertos efectos antidiabéticos.

En el estudio, el peso molecular promedio de HNCP3 fue mayor que el peso molecular promedio de UNCP4. La espectroscopia infrarroja indicó las características conformacionales de UNCP4 y HNCP3, es decir, los dos polisacáridos tenían picos de absorción característicos similares (vibración de estiramiento O–H, vibración de estiramiento C–H, vibración angular variable C–H y enlace C–O) y picos diferentes. transmitancias. Las imágenes AFM y SEM mostraron agregación molecular y conformación de polisacáridos. HNCP3 estaba suelto y presentaba una textura fibrosa blanda, mientras que UNCP4 estaba seco y presentaba algunas ramificaciones en la superficie. El ensayo del componente de monosacáridos mostró que la composición de monosacáridos de HNCP3 y UNCP4 difería solo en la proporción molar. La comparación de las actividades antioxidantes de los dos polisacáridos indicó que UNCP4 tenía fuertes actividades antioxidantes e hipoglucemiantes. En resumen, la extracción asistida por ultrasonido tuvo cierto efecto sobre la estructura y la conformación de la solución de NCP, especialmente el efecto sobre las propiedades de la solución y la conformación de la cadena podría afectar la actividad biológica de los polisacáridos. Por lo tanto, es de gran importancia estudiar sistemáticamente el efecto del ultrasonido en la estructura avanzada de los polisacáridos de la medicina tradicional china.

Nostoc commune es una planta perteneciente al género Nostocaceae, Cyanobacteria, Nostocaceae. Morfológicamente, inicialmente es gelatinoso y esférico, y luego se expande en laminillas, hasta 10 cm, como una corteza gelatinosa, de color oliva oscuro o marrón té, marrón oscuro o negro después del secado. Los filamentos de algas están enrollados, y sólo en el perímetro del grupo se observan vainas gelatinosas evidentes, de color marrón amarillento, gruesas y laminares, y constreñidas en el tabique transverso. Los cuerpos fructíferos secados al aire de N. commune se obtuvieron de Gansu Kangxinyuan Ecological Agriculture Technology Development Co., Ltd (Lanzhou, provincia de Gansu, China. La producción de materias primas se referirá al estándar empresarial de seguridad alimentaria Q/SXZN0001S-2019 Ground Las plantas blandas (ya sean cultivadas o silvestres), incluida la recolección de material vegetal, cumplieron con las directrices y la legislación institucionales, nacionales e internacionales pertinentes), pulverizadas hasta obtener un polvo fino de 0,178 mm mediante un pulverizador de alta velocidad (FZ102, Beijing Zhongxing Weiye Instrument Co., Ltd., Beijing, China), y se almacenó a temperatura ambiente hasta su uso. Los estándares de monosacáridos (es decir, ramnosa, arabinosa, galactosa, glucosa, xilosa, manosa, fucosa, ácido glucurónico) α-amilasa se adquirieron de Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (Beijing, China), 1,1-difenil-2 -picrilhidrazilo (DPPH), solución de acarbosa, p-nitrofenol glucopiranósido (PNPG) y α-glucosidasa se adquirieron de Sigma-Aldrich (EE. UU.). Todos los demás reactivos eran de grado analítico.

La HRE se realizó con base en el método informado anteriormente con algunas modificaciones62. El polvo de N. commune (5 g) se extrajo a reflujo con agua desionizada (250 mL) en un matraz de fondo plano a 85 °C durante 190 min, y el extracto se trató tres veces por el método Savage (cloroformo: alcohol butílico en proporción 4:1) para eliminar la proteína. La solución desproteinizante se precipitó (4 °C durante 12 h) mediante la adición de etanol anhidro hasta una concentración final del 80 % (V/V), y el precipitado se liofilizó mediante liofilizador al vacío (SCIENIZ-18 N, Ningbo Biotechnology Co. ., Ltd., Ningbo, China) para obtener polisacárido bruto de N. commune (HNCP).

El procedimiento detallado UAE de polisacáridos crudos (UNCP) se llevó a cabo como lo describimos anteriormente63. La UNCP se extrajo en condiciones óptimas de extracción en relación sólido-líquido de 1:50, solvente de etanol anhidro, temperatura de extracción de 353,15 K, potencia ultrasónica de 540 W, tiempo de extracción de 25 min, y luego se trató de acuerdo con la descripción en Apartado "Análisis de composiciones de monosacáridos".

Se prepararon 200 mg de HNCP y UNCP en una solución de 10 mg/mL y se cargaron en una columna de cromatografía de intercambio aniónico DEAE-52 (2,6 × 45 cm), respectivamente, y se eluyeron con un gradiente de NaCl gradual de 0–1,0 mol/L a el caudal de 1 ml/min. Las fracciones HNCP3 y UNCP4 se recogieron con solución de NaCl 0,3 mol/l, se dializaron (MWCO: 8–14 kDa) y se liofilizaron con un rendimiento de 24,5 mg. La muestra liofilizada se purificó adicionalmente con Sephadex G100 con agua desionizada a una velocidad de flujo de 1 ml/min para su posterior estudio. El peso molecular de HNCP3 y UNCP4 se determinó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento junto con dispersión de luz láser multiángulo como describimos anteriormente.

Como se describió en el informe anterior, las composiciones de monosacáridos de HNCP3 y UNCP4 se lograron mediante cromatografía de gases (GC)63, el procedimiento detallado fue de acuerdo con los métodos informados con algunas modificaciones. Se mezclaron 30 mg de HNCP3 y UNCP4 con 30 mL de solución de peryodato de sodio (15 mmol/L), y las mezclas se disolvieron suficientemente con un agitador magnético en un cuarto oscuro a 4 °C. Se pipeteó 1,0 ml de solución mixta en la ampolla, se colocó en un matraz volumétrico de 250 ml y se diluyó al volumen con agua desionizada. La absorbancia de la solución a 223 nm se midió mediante espectrofotómetro ultravioleta a intervalos de 6 h hasta que el valor de la absorbancia permaneció constante. El consumo de peryodato se calculó con la calibración de peryodato de sodio. A 2,0 mL de la solución de reacción se le añadieron 0,5 mL de etilenglicol para terminar la reacción y se valoró con solución estándar de NaOH (0,01 mol/L) con el indicador de fenolftaleína. Se registraron los volúmenes de valorante y se calculó la cantidad de ácido fórmico de acuerdo con la siguiente fórmula 1.

Tenga en cuenta que y es la producción de ácido fórmico, x es la concentración exacta de NaOH, n es el volumen de titulación, v es el volumen de reacción.

Las condiciones cromatográficas de GC fueron las siguientes: cromatógrafo de gases ThermoITQ1100; detector FID; columna capilar de cuarzo flexible HP-5 (0,32 mm × 0,25 μm × 30 m); N2 como gas portador; 1 ml/min como caudal; 1: 10 como relación de división; 220 °C como temperatura de entrada; 250 °C como temperatura del detector; aceleración programada (160 °C como temperatura inicial y rampa ascendente hasta 240 °C a 10 °C/min).

Las condiciones cromatográficas de HPLC fueron las siguientes: la columna era TSK-GELG6000PWXL; la fase móvil fue una solución acuosa de iteración de sodio al 0,2 %, la velocidad de flujo fue de 1 ml/min, la temperatura de la columna fue de 30 °C, el detector fue un detector de índice de refracción diferencial y el volumen de inyección fue de 20 μL.

La solución de reacción de oxidación de ácido peryódico anterior terminada en etilenglicol se transfirió a una bolsa de diálisis (3500 Da) y se dializó con agua destilada durante 48 h. Se añadieron 100 mg de borohidruro de sodio y se mezclaron en la oscuridad durante 24 h, luego la solución se neutralizó más con ácido acético al 50 % hasta que se descompuso el exceso de borohidruro de sodio. La solución neutralizada se dializó durante 48 h y se secó mediante liofilización. La muestra seca (10 mg) se hidrolizó con 2 mL de ácido trifluoroacético (2 mol/L) a 120 °C durante 3 h y se evaporó repetidamente con metanol para eliminar el exceso de ácido trifluoroacético. El residuo se trató con la mezcla de 0,5 mL de piridina y 10 mg de clorhidrato de hidroxilamina a 95 °C durante 30 min, y luego se acetiló con 0,5 mL de anhídrido acético a 95 °C durante 35 min. El acetilato se secó con nitrógeno, se disolvió con 1 ml de cloroformo y se lavó dos veces con agua destilada. Se utilizó 1 mL de solución de capa de cloroformo para la determinación por GC en las condiciones analíticas que establecimos64. Se tomaron 5 mg del estándar de monosacárido, glicerina y eritritol respectivamente y se realizaron análisis GC de acuerdo con el método descrito anteriormente.

En detalle, se disolvieron 10 mg de HNCP3 y UNCP4 en 1,5 ml de DMSO (1,5 ml), luego se agregaron 1,5 ml de solución de NaOH (50 %)-DMSO (V:V = 1:1) y se hizo reaccionar a 30 °C. durante 3 h. Se añadió yoduro de metilo (0,5 ml) y se agitó a 30 °C durante 2,5 h en un lugar oscuro bajo protección con N2 y la reacción se terminó con 1 ml de agua desionizada. El paso de operación anterior se repitió tres veces hasta que el pico de absorción del grupo OH desapareció sustancialmente. El HNCP3 y UNCP4 metilados se hidrolizaron adicionalmente con H2SO4 (2 mol/L) a 120 °C durante 2 h y se secaron mediante evaporación rotatoria bajo la protección de nitrógeno. La muestra secada por rotación se disolvió con solución de NaOH y se agitó con la adición de 25 mg de borohidruro de sodio a 25 °C durante 2 h, el pH se ajustó a 5,5–7,0 con ácido acético para eliminar el exceso de borohidruro de sodio.

Posteriormente, las muestras reducidas se acetilaron mezclándolas con 0,7 mL de piridina y 1 mL de anhídrido acético a 90 °C durante 30 min. El producto de reacción seco se disolvió en acetato de etilo y luego se analizó mediante un aparato del sistema GLC-MS (THERMO 1310 GC-ISQ LT MS, EE. UU.) equipado con una columna capilar TG-200MS (30 mm × 0,25 mm, 0,25 µm). El programa específico fue el siguiente: de 160 a 210 °C se elevó la temperatura a razón de 2 °C/min, luego se incrementó a 240 °C a razón de 5 °C/min y finalmente se mantuvo por 20 min. . El rango de exploración de MS se estableció en m/z 35–4000.

Se utilizó un espectrofotómetro FT-IR (Nicolet iS5, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) para determinar los grupos funcionales orgánicos de HNCP3 y UNCP4 en el rango de exploración de 4000–400 cm−1 con una resolución de 4 cm−165. HNCP3 y UNCP4 se colocaron en un crisol de Al2O3 y la temperatura se elevó a 350 °C a una velocidad de 10 °C/min con el gas de protección de nitrógeno en un analizador térmico simultáneo TGA/DSC (STA449C, Netzsch, Alemania)66. La temperatura de desnaturalización se calculó usando el software de análisis de datos Origin 9.0.

Para investigar el efecto de diferentes métodos de extracción en la microestructura de los polisacáridos, HNCP3 y UNCP4 se fijaron en obleas de silicio recubiertas de oro y se observaron mediante un microscopio electrónico de barrido (SEM, JSM-5600LV, American Kevex Company, América). Mientras tanto, se dejaron caer 50 µl de HNCP3 y UNCP4 (1,0 µg/ml) sobre sustrato de mica y se secaron a temperatura ambiente durante la noche. Luego, las transformaciones conformacionales de las macromoléculas HNCP3 y UNCP4 fueron estudiadas por AFM (MultiMode-HR, Brooke, EE. UU.)67.

De acuerdo con nuestro método previamente descrito65,68,69, se prepararon soluciones de HNCP3, UNCP4 y Vc con diferentes concentraciones (0.2 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.8 mg/mL, 1.0 mg/mL) para evaluar sus actividades antioxidantes en términos de capacidad de eliminación de radicales DPPH, capacidad de eliminación de aniones superóxido y capacidad de eliminación de radicales hidroxilo. En concreto, se añadió a los tubos de ensayo 1 ml de polisacáridos crudos de HNCP3 y UNCP4 con concentraciones de 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml y 1,0 mg/ml. Luego se agregaron 5 mL de solución de 5 mmol/L de DPPH, se agitó bien y se colocó en la oscuridad durante 30 min. Se utilizó como referencia la mezcla de 5 mL de etanol absoluto y 3 mL de agua destilada y se midió el valor de absorbancia a 517 nm. La actividad de eliminación de DPPH se calculó mediante la fórmula 2.

Nota A0 es la absorbancia de la solución de control en blanco con agua destilada en lugar de la solución de muestra; Ai es la absorbancia de la solución de muestra; Aj es la absorbancia de la solución de muestra con agua destilada en lugar de agente cromogénico.

1 mL de polisacáridos crudos de HNCP3 y UNCP4 con concentraciones de 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,8 mg/mL, 1,0 mg/mL y 3 mL de tampón Tris-HCl con un pH de 8,2. añadido a los tubos de ensayo. La reacción se llevó a cabo en un baño de agua a 25 °C durante 20 min. Después de agregar 0,3 mL de 7 mmol/L de pirogalol y reaccionar durante 4 min, se agregó 1 mL de 10 mol/L de HCl y se midió la absorbancia a 420 nm. La capacidad de eliminación del anión superóxido se calculó mediante la fórmula 2.

2 mL de polisacáridos crudos de HNCP3 y UNCP4 con concentraciones de 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,8 mg/mL, 1,0 mg/mL, 1 mL de 9 mmol/L FeSO4 y 2 mL de 9 Se agregaron mmol/L de solución de ácido salicílico y etanol a los tubos de ensayo. Luego se añadieron 2 mL de H2O2 8,8 mmol/L y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 h. El valor de absorbancia de las muestras se midió a 510 nm poniendo a cero con agua destilada. La capacidad de captación de radicales hidroxilo se calculó mediante la fórmula 2.

La capacidad antidiabética in vitro de HNCP3, UNCP4 se evaluó por su potencial inhibitorio contra la α-amilasa y la α-glucosidasa que podrían metabolizar los carbohidratos67. También se calculó la concentración de la muestra (IC50) para la capacidad de inhibir la enzima en un 50%. Específicamente, HNCP3 y UNCP4 se disolvieron en tampón de fosfato (0,2 mol/L, pH 6,6) a concentraciones de 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL. ml, respectivamente. Se agregaron 0,2 mL de solución de α-amilasa (6 U/mL) a las soluciones de muestra de diferentes concentraciones, seguidos de 0,4 mL de solución de almidón (1 %), y la reacción se realizó a 37 °C durante 10 min. Se agregaron secuencialmente 2 mL de reactivos DNS y se hicieron reaccionar en un lote de agua hirviendo durante 10 min, la absorbancia se midió a 520 nm como se describe en informes anteriores70. La tasa de inhibición de la α-amilasa se calculó según la Fórmula 3.

Tenga en cuenta que A0 es la absorbancia del control en blanco, A1 es la absorbancia de la muestra de polisacárido y A2 es la absorbancia del tubo base.

La actividad inhibidora de la α-glucosidasa se determinó midiendo la liberación de p-nitrofenol a 405 nm en una placa de 96 pocillos. La mezcla de reacción que contenía 20 µl de diferentes concentraciones de muestras, 10 µl de α-glucosidasa (2 U/ml), 50 µl de tampón fosfato (pH 6,8, 100 mM) se incubó a 37 °C durante 15 min. Luego, se agregaron 20 μl de p-nitrofenol glucopiranósido (PNPG) (5 mM) y se incubó a la misma temperatura durante 20 min. La reacción se detuvo mediante la adición de 150 μl de carbonato de sodio (0,1 M). Se usó acarbosa como estándar. La tasa de inhibición se calculó de acuerdo con la fórmula 4.

A0 es la absorbancia del blanco, A1 es la absorbancia de la muestra de polisacárido, A2 es la absorbancia del blanco de la muestra y A3 es la absorbancia del control.

Los datos se expresaron como media ± SD y se examinaron por su significancia estadística de diferencia con varianza (ANOVA) y pruebas T (y pruebas no paramétricas) por GraphPadPrism5. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el artículo y el material complementario, las consultas adicionales pueden dirigirse al autor correspondiente.

Análisis de variación

Polisacárido comuna de Nostoc

Extracción de reflujo de calefacción

Extracción asistida por microondas

Extracción asistida por ultrasonidos

Espectro termogravimétrico

Calorimetría diferencial de barrido

Vitamina C

Polisacárido 3 de Nostoc commune obtenido por extracción con reflujo caliente

Polisacárido 4 de Nostoc commune obtenido por extracción asistida por ultrasonidos

1,1-Difenil-2-picrilhidrazilo

P-nitrofenol glucopiranósido

Cromatografía de gases

Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier

La mitad de la concentración inhibitoria máxima

Dimetilsulfóxido

Espectrometría de masas por cromatografía gas-líquido

Analizador termogravimétrico

Corte de peso molecular

Dietilaminoetilo-52

Microscópio electrónico escaneando

Microscopio de fuerza atómica

Actividad depuradora de radicales hidroxilo

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Este trabajo fue apoyado financieramente por Investigación sobre tecnología de prevención y control de importantes enfermedades epidémicas de yaks: Estudio sobre nuevas preparaciones de medicamentos veterinarios tibetanos (No. XZ202101ZD0002N-05), Programa de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícolas de la Academia China de Ciencias Agrícolas (ASTIP, CAAS-LMY-03), y el Proyecto del Equipo de Talento Empresarial e Innovación Juvenil de Gansu Longyuan (No. 2022lLQTD38). Agradecemos al Instituto de Física Química de Lanzhou, Academia de Ciencias de China, por su apoyo técnico para determinar la estructura de NCP.

Estos autores contribuyeron por igual: Xinjian Wang y Zhen Yang.

Laboratorio clave del proyecto de nuevos medicamentos para animales, provincia de Gansu, Laboratorio clave de desarrollo farmacéutico veterinario, Ministerio de Agricultura y Asuntos Rurales, Instituto de Ganadería y Ciencias Farmacéuticas de Lanzhou de la Academia China de Ciencias Agrícolas, Lanzhou, 730050, República Popular de China

Xinjian Wang, Zhen Yang, Yu Liu, Xuehong Wang, Hongjuan Zhang, Ruofeng Shang, Baocheng Hao y Shengyi Wang

Instituto de Ciencia Animal y Veterinaria, Academia Tíbet de Ciencias Agrícolas y de Cría de Animales, Lhasa, 850009, República Popular de China

Cidan Laba y Cuomu Wujin

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XW, BH y SW concibieron y diseñaron el estudio. XW, ZY y BH redactaron el manuscrito. ZY, XW, CL y CW realizaron la actividad antioxidante y antidiabética in vitro; YL, HZ y RS ayudaron a analizar la estructura de NCP; BH y SW son los autores correspondientes de este artículo.

Correspondencia a Baocheng Hao o Shengyi Wang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Wang, X., Yang, Z., Liu, Y. et al. Característica estructural del polisacárido aislado de Nostoc commune, y su potencial como actividad antidiabética y captadora de radicales. Informe científico 12, 22155 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26802-x

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Recibido: 21 de marzo de 2022

Aceptado: 20 de diciembre de 2022

Publicado: 22 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26802-x

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