Ingeniería de microfábricas de oxígeno para retardar la progresión tumoral a través de microambientes hiperóxicos

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4495 (2022) Citar este artículo

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Si bien la hipoxia promueve la carcinogénesis, la agresividad tumoral, la metástasis y la resistencia a los tratamientos oncológicos, los impactos de la hiperoxia en los tumores rara vez se exploran porque proporcionar un suministro de oxígeno duradero in vivo es un desafío importante. Aquí, construimos micro fábricas de oxígeno, a saber, microcápsulas de fotosíntesis (PMC), mediante la encapsulación de cianobacterias adquiridas y nanopartículas de conversión ascendente en microcápsulas de alginato. Este sistema permite un suministro de oxígeno de larga duración a través de la conversión de la radiación externa en emisiones de longitud de onda roja para la fotosíntesis en cianobacterias. El tratamiento con PMC suprime la vía NF-kB, la producción de HIF-1α y la proliferación de células cancerosas. El microambiente hiperóxico creado por un implante de PMC in vivo inhibe el crecimiento y la metástasis del hepatocarcinoma y tiene efectos sinérgicos junto con anti-PD-1 en el cáncer de mama. Las fábricas de oxígeno de ingeniería ofrecen potencial para estudios de biología tumoral en microambientes hiperóxicos e inspiran la exploración de tratamientos oncológicos.

La hipoxia es la característica más generalizada de los microambientes de los tumores sólidos1,2 y surge de un desequilibrio entre el suministro insuficiente de oxígeno y el aumento del consumo de oxígeno por las células cancerosas que proliferan rápidamente. En consecuencia, las células cancerosas recurren a múltiples vías de adaptación y cambios genómicos para sobrevivir en ambientes hipóxicos3. El factor de transcripción factor inducible por hipoxia 1α (HIF-1α), el mediador más reconocido de las respuestas hipóxicas, juega un papel central en la estimulación de la neovascularización en los tumores para mejorar el suministro de oxígeno y nutrientes4. Paradójicamente, estos vasos a menudo están organizados de manera irregular (p. ej., estructuras torcidas, hiperpermeables y ciegas) y tienen defectos en la difusión o perfusión de oxígeno5, lo que resulta en expansiones de regiones hipóxicas en los tumores. Al mismo tiempo, se ha informado que el microambiente hipóxico, un sello distintivo de los tumores malignos, no solo es la principal barrera que protege al tumor de diversas terapias al crear un ambiente de inmunosupresión6, activar la vía de reparación del ADN7 y permitir el flujo autofágico8, sino también un promotor de la carcinogénesis9 , invasividad tumoral y metástasis1,2. Estos hallazgos inspiraron la exploración de tecnologías para convertir microambientes hipóxicos en microambientes hiperóxicos para estudios de terapia o biología tumoral.

Es un gran desafío construir un microambiente hiperóxico de larga duración en los tumores debido a la falta de fuentes de oxígeno constantes y biocompatibles. Teniendo en cuenta que los microbios de las algas son los principales proveedores de O2 en la Tierra, la fotosíntesis en los cloroplastos de las algas podría explorarse potencialmente para obtener suplementos de O2 en los tumores. La maquinaria fotosintética requiere una fuente de luz combinada que emita fotones de 650 a 700 nm. Dado que las nanopartículas de conversión ascendente basadas en tierras raras (UCNP) han demostrado una capacidad extraordinaria para convertir láseres biotransparentes del infrarrojo cercano (NIR) en luz visible10, estos materiales podrían explotarse para proporcionar fotones disponibles en la fotosíntesis. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que se podría crear un microambiente hiperóxico de larga duración mediante la construcción racional de microbios de algas y UCNP.

En este estudio, somos pioneros en una microcápsula de fotosíntesis (PMC) al encapsular cianobacterias y UCNP en microcápsulas de alginato (MC) que pueden fabricarse mediante una técnica de gota electrostática. Cuatro cepas de cianobacterias se sometieron a selección de aclimatación para adquirir una cepa adecuada para adaptarse a las condiciones fisiológicas. Exploramos exhaustivamente los impactos de la radiación NIR, la población celular y la dosis de UCNP en la producción de O2 para diseñar una fórmula optimizada de PMC. Los impactos de los microambientes hiperóxicos creados por las PMC se examinan en nueve líneas de células cancerosas y dos modelos tumorales, incluido el cáncer de mama ortotópico en ratones y el hepatocarcinoma trasplantado en conejos.

Para demostrar nuestra hipótesis, primero intentamos diseñar el sistema PMC propuesto, incluida la selección de microbios de algas aclimatados a condiciones fisiológicas, la síntesis de UCNP compatibles con la fotosíntesis y la encapsulación de microbios de algas y UCNP en MC. Cuatro microbios de algas parentales, es decir, el Synechocystis sp esférico. 6803 (S. sp. 6803), Chlorella ellipsoidea (C. ellipsoidea), Synechococcus elongates 7942 (S. elongate. 7942) en forma de bastón y Scenedesmus obliquus (S. obliquus) en forma de bote, fueron seleccionados en esta investigación. (Fig. 1 complementaria). Dado que estos microbios de algas cultivados en medios BG11 a 25 °C no pueden sobrevivir en medios de cultivo de células de mamíferos (p. ej., DMEM) a 37 °C, se sometieron a un procedimiento de aclimatación que permitió que las células crecieran en condiciones fisiológicas mediante alternancias escalonadas de temperatura ( 25 a 37 °C) y composición del medio (medio BG11 a DMEM). La aclimatación podría evaluarse evaluando la densidad celular en función de la absorbancia de la clorofila α a 650–700 nm11. Como se muestra en la Fig. 2 complementaria, mientras que la proliferación de S. obliquus y C. ellipsoidea se inhibió significativamente a temperaturas >32 °C, S. sp. 6803 y S. alargadas. 7942 pudieron aclimatarse a los incrementos de temperatura. Los cambios graduales del medio BG11 a DMEM nos permitieron adquirir una S. sp. evolucionada. 6803 (eS. sp. 6803), que mantuvo su actividad a 37 ° C en DMEM (Fig. 3 complementaria). Por lo tanto, se seleccionó esta cepa para la construcción de PMC. Luego sintetizamos una serie de UCNP con diferentes emisiones por el método de crecimiento de cristales10. Se descubrió que una nanovarilla de NaYF4 dopada con Er3+ e Yb3+ (15,3 × 30,2 nm) emite una fuerte fluorescencia a 660 nm, lo que coincide perfectamente con la absorbancia de la clorofila α (Fig. 4 complementaria y Fig. 5 complementaria), que es el componente prominente responsable para la fotosíntesis. A continuación, diseñamos las PMC encapsulando microbios de algas y UCNP en microesferas de alginato de calcio bajo un campo electrostático a través de un sistema de generación de gotas electrostáticas. Como se muestra en la Fig. 1, todo el proceso consta de cuatro pasos: (i) mezcla homogénea de microbios de algas con UCNP en alginato de sodio; (ii) dispersión de solución de alginato de sodio en gotitas uniformes bajo un campo electrostático; (iii) encapsular UCNP y microbios mediante alginato de calcio reticulado en soluciones de CaCl2; y (iv) recubrimiento de microesferas de alginato de calcio por poli-L-lisina (PLL), un policatión soluble en agua que es resistente a la degradación enzimática y capaz de prevenir la fuga de microbios (Fig. 6 complementaria). Las PMC resultantes se examinaron mediante microscopía de luminiscencia de conversión ascendente. Mientras que los MC vacíos y los MC encapsulados en algas no tenían señales de fluorescencia, los PMC emitían una fuerte fluorescencia roja bajo una excitación de 980 nm (Fig. 2a). Estos resultados indicaron que los UCNP encapsulados mantuvieron completamente sus propiedades ópticas. Examinamos exhaustivamente los impactos de la densidad de microbios y la concentración de UCNP en la actividad fotosintética de las PMC (Fig. 2b). Se adquirió una fórmula optimizada de PMC (3 × 103 células de algas y 0,67 μg de UCNP por MC) para la producción eficiente de oxígeno (1,6 μg/min). La generación de oxígeno de los PMC designados dependía de la intensidad y el tiempo de exposición de la radiación NIR, lo que indica un suministro de oxígeno controlable (Fig. 7 complementaria). Los microbios de algas encapsulados en PMC sobrevivieron en DMEM durante más de 1 mes (Fig. 8 complementaria).

(i) mezcla homogénea de microbios de algas con UCNP en alginato de sodio; (ii) dispersión de solución de alginato de sodio en gotitas uniformes bajo un campo electrostático; (iii) encapsular UCNP y microbios mediante alginato de calcio reticulado en soluciones de CaCl2; y (iv) recubrimiento de microesferas de alginato-calcio por poli-L-lisina (PLL).

a Imágenes de PMC construidos. Los MC vacíos, los MC que contenían células de algas (eS. sp. 6803 @ MC) y los PMC completamente construidos se sometieron a imágenes mediante microscopía de luminiscencia de conversión ascendente a 980 nm. El borde de los MC se describe con un contorno blanco. b Un mapa de calor que presenta la producción de O2 por PMC con diferentes formulaciones. Se mezclaron células de algas a 107-1011 células/mL, UCNP a 0-100 mg/mL y 1 mL de alginato de sodio para preparar diferentes formulaciones de PMC mediante un sistema de generación de gotas electrostáticas. Los PMC resultantes se expusieron a radiación NIR de 900 mW/cm2 durante 20 min para medir los niveles de O2 con un medidor portátil de oxígeno disuelto. c Visualización de especies de oxígeno sintetizadas en PMC mediante tinción con DCFH. PMC, es. sp. Los 6803@MC y los UCNP@MC cultivados en la oscuridad durante 12 h se incubaron con 10 μg/ml de DCFH durante 10 min y luego se expusieron a radiación NIR de 300 mW/cm2 y 980 nm durante 0, 1, 3 y 10 min. Las microesferas tratadas se visualizaron inmediatamente mediante microscopía confocal a una excitación de 488 nm. El borde de los MC se describe con un contorno blanco. d Imagen esquemática para mostrar la detección de pO2 en tumores. e Mediciones de las presiones parciales de oxígeno (pO2) en los núcleos de los tumores en diferentes momentos. Los datos se presentan como medias ± SD derivadas de tres tumores. f visualización visual de pO2 en tumores. Se usó un electrodo de oxígeno Clark para medir la pO2 en tumores de mama de ratón que recibieron tratamientos con solución salina, PMC, NIR, oxígeno hiperbárico (60%) y NIR-PMC. Los valores de pO2 se registraron en tumores a 5 mm de profundidad durante 7 días o diferentes profundidades de tumores 1 hora después de los tratamientos con NIR-PMC. Python integró los valores de pO2 en la sección transversal más grande de tumores para la construcción de los mapas de calor. El borde del tumor se describe con un contorno negro. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego, examinamos la capacidad de oxigenación de las PMC en soluciones fisiológicas y en tumores. Las PMC se incubaron primero en DMEM a 37 °C. El oxígeno a menudo se genera junto con otras especies de oxígeno en la fotosíntesis de los cloroplastos12. La producción de radicales oxidativos en las PMC se examinó mediante tinción con 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (DCFH)13 para evaluar la actividad fotosintética. El DCFH no fluorescente podría oxidarse en 2',7'-diclorofluoresceína (DCF), emitiendo fluorescencia verde en condiciones hiperóxicas. Como se muestra en la Fig. 2c, se detectaron señales de fluorescencia intensa en PMC completamente construidas, mientras que las PMC sin algas y sin UCNP mostraron señales limitadas. El oxígeno liberado en el medio se controló continuamente durante 24 h. Como se muestra en la Fig. 9 complementaria, las PMC podían sintetizar oxígeno de manera estable, que alcanzó 6,2 ± 0,5 mg/L 1 h después de la exposición NIR y disminuyó lentamente a 3,0 ± 0,3 mg/mL en 24 h. Dadas las presiones intersticiales de 20–40 mmHg en tumores sólidos14,15,16, se examinaron sus impactos en la fotosíntesis de las PMC. Como se muestra en la Fig. 10 complementaria, diseñamos un dispositivo que consiste en una jeringa sellada de 10 ml, pesas calibradas y electrodos Clark para la detección dinámica de la presión parcial de oxígeno (pO2) a diferentes presiones. Mientras que la pO2 en DMEM alcanzó 105,7 ± 6,1 mmHg a presión atmosférica normal, la presión adicional tuvo poco efecto en los perfiles de oxigenación de las PMC. Además, se evaluó la oxigenación de las PMC en el tumor de mama. Como se muestra en la Fig. 2d, e, la pO2 en el núcleo (~5 mm hasta la capa externa) de los tumores alcanzó picos (27,2–35,4 mmHg) 1 h después de la exposición NIR y disminuyó lentamente a niveles basales de 10,8–12,3 mmHg a las 24 horas Las curvas de oxigenación mostraron patrones similares en siete ciclos de exposición NIR, lo que indica una actividad fotosintética estable de las PMC en los tumores. En comparación con el oxígeno hiperbárico, la pO2 en los núcleos tumorales alcanzó niveles 6,7 veces más altos en el tratamiento con NIR-PMC. Se construyeron mapas de calor para evaluar visualmente la pO2 desde la capa externa del tumor hasta el núcleo interno (Fig. 2f). Mientras que los tumores no tratados (control) tenían hipoxia severa en los tumores profundos, los colores verde amarillentos en los tumores tratados con NIR-PMC sugerían elevaciones significativas en los niveles de oxígeno. Estos resultados documentaron minuciosamente la capacidad de oxigenación de las PMC in vitro e in vivo.

Luego nos preguntamos si el suministro de O2 por parte de las PMC puede afectar la proliferación de células cancerosas. Los efectos de las PMC se evaluaron en nueve líneas celulares de cáncer, incluidas las de mama (MCF-7, 4T1), pulmón (A549), hígado (HepG2, VX2), intestinal (HCT116), pancreático (PANC-1), estomacal (MGC- 803) y células cervicales (HeLa), en tres especies de mamíferos (humano, ratón y conejo) y tres líneas celulares primarias (fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), células cardíacas y renales). Las actividades metabólicas de las células se examinaron mediante un sustrato colorimétrico en un ensayo MTS. Para evitar los efectos citotóxicos del calor en la radiación NIR, la dosis de exposición NIR se fijó en 300 mW/cm2 durante 20 min (Fig. 11 complementaria). Se aplicaron tres intervalos de radiación NIR a las CMP en cultivo de 24 h para crear un biocontexto hiperóxico con niveles de oxígeno de 1,8 a 5,3 mg/L. Como se muestra en la Fig. 3a y la Fig. 12 complementaria, las PMC junto con NIR (NIR-PMC) tuvieron poca citotoxicidad en tres líneas celulares normales pero inhibieron la proliferación de ocho líneas celulares cancerosas. En particular, los medios con suficiente oxígeno suprimieron por completo las duplicaciones de las células HCT116, HepG2, MCF-7 y 4T1. Examinamos exhaustivamente los impactos de las integraciones de PMC en detalle, incluidas las MC, las algas y las UCNP, en las células MCF-7 y HepG2 con o sin radiación NIR. Como resultado, el efecto de supresión se detectó principalmente en células bajo tratamiento con NIR-PMC (Fig. 3b y Fig. 13 complementaria). Para demostrar aún más este punto, visualizamos las nuevas células cancerosas hijas mediante un kit de ensayo de proliferación BeyoClick-iT® EdU-594 que consiste en EdU (5-etinil-2′-desoxiuridina) que podría incorporarse en el ADN recién sintetizado y marcado con fluorescencia por una reacción de clic específica17. Como se muestra en la Fig. 3c, el tratamiento con NIR-PMC suprimió significativamente la proporción de células hijas divididas de células de cáncer de mama (MCF-7) y hepatocarcinoma (HepG2), como lo demuestra la reducción de células positivas para EdU (rojo). En particular, los medios de hiperoxia se invalidaron una vez que se eliminó el oxígeno disuelto mediante la purga de N2 (Fig. 14 complementaria), lo que sugiere que el oxígeno, en lugar de los metabolitos de las células de algas, fue el responsable del efecto de supresión de las NIR-PMC. El análisis de citometría de flujo indicó pocas muertes de células apoptóticas (Fig. 15 complementaria).

una evaluación de la proliferación celular. Células HCT116, 4T1, HepG2, VX2, MCF-7, PANC-1, MGC-803, HeLa y A549 incubadas con o sin PMC (25 μL, 3,6 × 104/mL) se expusieron a radiación NIR de 300 mW/cm2 durante tres intervalos Después de 24 h, se examinó la viabilidad celular mediante ensayos MTS (n = 6). Los datos se presentan como media ± SD. ***p < 0,001 en comparación con las células de control según la prueba t de Student de dos colas. b Impactos de integra en PMCs. Las células HepG2 se incubaron junto con MC, UCNP@MC, e-synechocystis@MC y PMC en presencia o ausencia de radiación NIR para evaluar la viabilidad celular (n = 6). Los datos se presentan como la media ± SD. ***p < 0,001 y **p < 0,01 en comparación con el grupo de control según la prueba t de Student de dos colas. c Visualización confocal de nuevas células hijas. Las células HepG2 y MCF-7 después del tratamiento con NIR-PMC se tiñeron con un kit de ensayo BeyoClick-iT® EdU-594 (barra de escala: 20 μm) para obtener imágenes confocales. d Los efectos celulares de NIR-PMC en la vía de señalización de NF-κB. Las células HepG2 se pretrataron con NIR-PMC (radiación NIR de 300 mW/cm2 durante tres intervalos). Después de 24 h, todas las células se pretrataron con BMS 20 nM y 2 µl de dimetilsulfóxido (DMSO) (en blanco) durante 2 h antes de la estimulación con 200 ng/ml de TNFα durante 10 min. Los lisados ​​​​celulares se recolectaron y se sometieron a análisis de transferencia Western de IκBα e IκBα fosforilado (n = 3, las muestras derivan del mismo experimento y las transferencias se procesaron en paralelo). Las proporciones de p-IκBα frente a β-actina se determinaron mediante ImageJ 1.51. Los datos se presentan como la media ± SD. *p < 0,05 en comparación con las células de control según la prueba t de Student de dos colas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Dado que las NIR-PMC tuvieron un efecto limitado en las células primarias pero suprimieron significativamente la proliferación de células cancerosas, especulamos que la hiperoxia podría afectar específicamente las señales en las vías de carcinogénesis. Dado que el factor nuclear kappa B (NF-κB), la fosfoinositol 3'-quinasa (PI3K), la proteína quinasa B (AKT), la diana de rapamicina en mamíferos (mTOR), la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) y la quinasa regulada por señales extracelulares ( ERK) juegan un papel crucial en la supervivencia y proliferación de células cancerosas18,19,20,21, se examinaron en células HepG2 mediante inmunotransferencia. El factor de crecimiento endotelial (EGF), la insulina y el TNF-α se aprovecharon como inductores22,23,24 y se incluyeron como inhibidores 3-metiladenina (3-MA), MK-2206, rapamicina, PD98059 y BMS-345541 (BMS)25, 26,27,28,29,30. Como se muestra en la Fig. 3d y la Fig. 16 complementaria, se detectó una supresión significativa de IκBα fosforilado (p-IκBα) en células tratadas con PMC. Por el contrario, NIR-PMC tuvo poco impacto en las expresiones de ERK, PI3K, AKT y mTOR. Estos resultados indicaron que el efecto de las NIR-PMC sobre la inhibición de la proliferación se asoció principalmente con la vía NF-κB. Para confirmar aún más el papel de NF-κB, intentamos alterar la actividad de NF-κB en presencia o ausencia de PMC para examinar la proliferación celular mediante la tinción de nuevas células hijas (Fig. 17 complementaria). La proliferación de células cancerosas podría ser inhibida por BMS pero potenciada por TNF-α en ausencia de PMC. En particular, en presencia de PMC, mientras que BMS mostró un efecto inhibidor más fuerte sobre el crecimiento celular, TNF-α no logró impulsar las duplicaciones celulares.

Estudios sustanciales han demostrado que la hipoxia es responsable de la supresión inmunitaria del microambiente tumoral por la liberación de adenosina y HIF-1α inducida por la hipoxia en las células cancerosas y la inhibición de la función de las células inmunitarias al aumentar la cantidad de receptores de adenosina A2A (A2AR)31,32 ,33. Especulamos que la hiperoxia por NIR-PMC puede aumentar la actividad inmune al eliminar el eje hipoxia/HIF-1α/adenosina/A2AR. Para probar esta especulación, examinamos los efectos de NIR-PMC en esferoides de células cancerosas construidos por encapsulación de células HepG2 o MCF-7 en Matrigel. En primer lugar, se utilizó la sonda hipoxíptica FITC-MAb1 para evaluar el estado de hipoxia en esferoides de células cancerosas. Como se muestra en la Fig. 4a, se observó una fluorescencia verde intensa en los esferoides no tratados, lo que indica hipoxia grave, mientras que el tratamiento con NIR-PMC elevó los niveles de oxígeno y mejoró el estado de hipoxia. La cuantificación del factor 1α inducible por hipoxia (HIF-1α) en lisados ​​celulares mediante ELISA indicó que el tratamiento con NIR-PMC redujo drásticamente los niveles de HIF-1α de 335,7 a 148,3 pg/mg de proteína en esferoides de células HepG-2 y de 614,6 a 107,9 pg/mg de proteína en esferoides de células MCF-7 (Fig. 4b). En consecuencia, las producciones de adenosina tuvieron disminuciones del 42, 9% y 71, 7% en los esferoides de células MCF-7 y HepG-2, respectivamente (Fig. 4c). Se examinó la producción de IFN-γ34,35 para evaluar la función efectora de las células T después del tratamiento con hiperoxia. Por lo que se incluyó acetato de miristato de forbol (PMA) como inductores de activaciones de células T. Como se muestra en la Fig. 4d, e, en ausencia de PMA, las células T pretratadas con o sin NIR-PMC solo produjeron niveles insignificantes de IFN-γ. Por el contrario, el porcentaje de células T productoras de IFN-γ en el grupo de tratamiento con NIR-PMC se elevó notablemente al 13,5 % en presencia de PMA, que fue aproximadamente 2,6 veces mayor que sin pretratamiento con NIR-PMC. Para probar el efecto potencial de las NIR-PMC en la actividad citolítica de las células NK, se utilizó como células diana la línea celular de linfoma de ratón Yac-1 sin MHC, altamente sensible a las células NK36,37. Como se muestra en la Fig. 4f, después del cocultivo durante 6 h, las células NK eliminaron hasta el 95,6 % de las células Yac-1 en el tratamiento con NIR-PMC y, en marcado contraste, solo se eliminó el 58,3 % de las células Yac-1. en los grupos de control. Estos resultados indicaron la revitalización de la función efectora de las células T y NK en un entorno hiperóxico creado por NIR-PMC.

a Imagen confocal del estado hipóxico. Se incorporaron células HepG2 y MCF-7 en matrigel para preparar esferoides. Después de 7 días de incubación, los esferoides construidos se expusieron a 3600 PMC/mL y recibieron radiación NIR de 300 mW/cm2 durante tres intervalos. Los esferoides tratados se tiñeron con HypoxyprobeTM-1 Plus Kit (verde) y Hoechst 33342 (azul). b Producción de HIF-1α y c adenosina en esferoides de células cancerosas (n = 3). Las células en esferoides se recolectaron y lisaron para la detección de HIF-1α o adenosina por ELISA y LC-MS, respectivamente. d Imágenes representativas y e cuantificación de la expresión de IFN-γ en células T mediante análisis de citometría de flujo (n = 3). Las células T se trataron con 50 ng/ml de PMA y 1 µl/ml de inhibidor de Golgi durante 18 h con/sin NIR-PMC durante tres intervalos. Las células tratadas se fijaron, permeabilizaron y tiñeron con anti-IFN-γ-FITC para análisis de citometría de flujo. f Impactos de la hiperoxia en la actividad citolítica de las células NK (n = 3). Las células NK clasificadas (2 × 105 células/pocillo) se mezclaron con células Yac-1 en proporciones de 1:1 o 2:1 en placas de 24 pocillos y se cocultivaron con/sin PMC, seguido de tres intervalos de exposición NIR. Después de 6 h de incubación, las mezclas de células se recogieron para lisar las células Yac-1. La luminiscencia de los lisados ​​celulares se midió mediante un lector de microplacas. Los datos se expresan como media ± SD. **p < 0,01 y ***p < 0,001 en comparación con las celdas Ctrl mediante la prueba t de Student de dos colas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, examinamos los impactos in vivo de los suplementos de oxígeno en el hepatocarcinoma mediante la implantación in situ de PMC en el hígado de conejos. Para determinar una dosis de radiación segura y efectiva in vivo, examinamos los impactos de la radiación NIR en los cambios patológicos de la piel, así como en la generación de oxígeno. Se seleccionó una dosis de radiación NIR de 900 mW/cm2 durante 20 min para el tratamiento de animales porque creaba un microambiente hiperóxico (2,7–3,4 mg/L) y evitaba el daño tisular inducido por la hipertermia (Fig. 18 complementaria). Más del 65% de las cianobacterias en las PMC sobrevivieron en el hígado durante al menos 1 mes (Figura complementaria 19). Como se indica en el esquema de tratamiento (Fig. 5a), los conejos con hepatocarcinoma que recibieron una inyección intratumoral de PMC (500 μL, 3,6 × 104/mL) se expusieron a radiación NIR de 980 nm durante 42 días. El tratamiento con NIR-PMC creó un microambiente tumoral hiperóxico de larga duración, evidenciado por una reducción dramática en la expresión de HIF-1α (Fig. 5b). En consecuencia, los objetivos aguas abajo de HIF-1α, incluida la proteína 3 que interactúa con la proteína E1B de BCL2/adenovirus (BNIP-3), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-2), la metaloproteinasa de matriz-2 ( MMP2) y el factor de crecimiento transformante-alfa (TGF-α), disminuyeron significativamente después del tratamiento con NIR-PMC (Figura 20 complementaria y Tabla 2 complementaria). Estos objetivos desempeñan papeles cruciales en la supervivencia, proliferación y metástasis de las células cancerosas, y su disminución implica la supresión del crecimiento tumoral38,39,40,41.

a Ilustración del tratamiento con NIR-PMC en conejos con tumores de hepatocarcinoma. A los 14 días posteriores a la implantación del tumor (el tamaño del tumor es de ~1 cm3), se inyectaron intratumoralmente 500 µl de PMC (3,6 × 104/ml) en conejos, seguidos de radiación NIR de 900 mW/cm2 durante 42 días. b Inmunotinción de HIF-1α en tumores hepáticos. Después de 28 días, los conejos se sacrificaron para recolectar tejidos tumorales. Las muestras de tejido se fijaron en formalina al 4% para la tinción inmunohistoquímica. Las proporciones de células positivas para HIF-1α (panel izquierdo) se calcularon mediante un escáner de patología digital (DMetrix). Los datos se presentan como la media ± SD derivada de tres imágenes de tumores de hígado de conejo independientes. **p < 0,01 en comparación con el control del vehículo según la prueba t de Student de dos colas. c Imágenes de TC axiales representativas del crecimiento tumoral. Se trataron conejos portadores de tumores con o sin NIR-PMC. Los animales sanos, portadores de tumores y tratados con NIR-PMC se sometieron a imágenes de TC a los 0, 14, 28 y 42 días. La forma/borde de los tumores de hepatocarcinoma se describen con un contorno amarillo (barras de escala, 1 cm). d Medición de los tamaños de los tumores mediante imágenes de TC. Los tamaños de los tumores de hepatocarcinoma se midieron con Neusoft PACS/Ris V5.5 a los 28 días posteriores al tratamiento (n = 3). Los datos se presentan como la media ± SD. **p < 0,01 en comparación con los datos de conejos portadores de tumores de hepatocarcinoma no tratados según la prueba t de Student de dos colas. e Imágenes de TC axiales representativas de metástasis de tumores pulmonares. Se tomaron imágenes de los pulmones de los animales mediante TC a los 0, 14, 28 y 42 días después del tratamiento. Los nódulos de metástasis pulmonares se describen con flechas amarillas. f El número de nódulos de metástasis pulmonares en pulmones de conejo (n = 3). Los datos se presentan como la media ± SD. *p < 0,05 en comparación con los animales no tratados según la prueba t de Student de dos colas. g Curvas de Kaplan-Meier que muestran las tasas de supervivencia de los conejos indicados a los 140 días (n = 10). Los datos se presentan como *p < 0,05, en comparación con los datos de conejos portadores de tumores de hepatocarcinoma no tratados según la prueba de rangos logarítmicos del software estadístico SPSS 17.0. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El crecimiento del tumor se examinó mediante imágenes de TC durante 42 días (Fig. 5c). Mientras que el tamaño de los tumores en los conejos no tratados aumentó rápidamente a 4 cm3 el día 14 y a 16 cm3 el día 28, el tratamiento con NIR-PMC inhibió por completo el crecimiento del tumor en 14 días y mostró un aumento lento en el tamaño de los tumores a 4 cm3 el día 28 (Figura 5d). Dado que el pulmón es el órgano diana más común para la metástasis de hepatocarcinoma42, también examinamos este órgano mediante imágenes de TC. Como se muestra en la Fig. 5e, se pudieron diferenciar signos notables de metástasis en los pulmones de conejos portadores de tumores no tratados a los 14 días, y se formó una gran cantidad de focos tumorales (51 ± 25/pulmón) el día 28. En particular, hubo pocas metástasis pulmonares detectables en los tratamientos con NIR-PMC incluso en el día 42 (Fig. 5f, Fig. 21 complementaria). Consistentemente, las secciones de hígado de conejos que recibieron tratamiento con NIR-PMC mostraron una reducción dramática en el biomarcador de metástasis tumoral molécula de adhesión de células vasculares 1 (VCAM-1) 43 (Fig. 22 complementaria). Los diagramas de Kaplan-Meier para las comparaciones de tasas de supervivencia se generaron mediante el seguimiento diario continuo de los animales en el punto de estado moribundo o muerte espontánea. Las pruebas de rango logarítmico demostraron un beneficio de supervivencia estadísticamente significativo (p < 0,05) para el tratamiento con NIR-PMC en comparación con el tratamiento de control con vehículo (Fig. 5g). En particular, dos de cada diez conejos vivieron más de 140 días y casi se curaron, ya que no hubo nódulos tumorales detectables en los hígados y los pulmones mediante imágenes de TC y examen ex vivo (Fig. 23 complementaria). Para nuestra sorpresa, todavía se podían observar PMC luminiscentes en el hígado y morfologías esféricas mantenidas (Fig. 23 complementaria). Estos resultados indicaron que el microambiente hiperóxico creado por NIR-PMC podría retardar en gran medida la progresión tumoral, inhibir la metástasis tumoral y mejorar las tasas de supervivencia de los conejos portadores de hepatocarcinoma.

Dado que las especies de oxígeno se han informado ampliamente como requisitos previos de la activación inmunitaria44, especulamos que los suplementos de oxígeno de larga duración por NIR-PMC pueden facilitar la inmunoterapia al activar respuestas inmunitarias adaptativas en el microambiente tumoral. Verificamos esto mediante análisis LC-MS de adenosina e inmunotinción de la expresión de CD4, CD39, CD206 y CD73 en un modelo de tumor de mama ortotópico mediante la inoculación de células tumorales 4T1 (fLuc-4T1) transfectadas con luciferasa de luciérnaga en las almohadillas mamarias de ratones BALB/c. . Como se muestra en la Fig. 6a, b, el tratamiento con NIR-PMC mejoró significativamente la producción de HIF-1α y adenosina, mejoró la expresión de CD4 y redujo las expresiones de CD39, CD206, CD73 y A2AR en secciones tumorales; esto indicó que las células T auxiliares, las células B y las células NK se activaron y que se produjo la diferenciación de los macrófagos M1 en el microambiente tumoral45,46. Por lo tanto, podría esperarse un efecto terapéutico sinérgico para un tratamiento combinado de NIR-PMC e inhibidores de puntos de control. Los ratones con tumores examinados mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI) se separaron aleatoriamente en cuatro grupos: sin tratamiento (control del vehículo), tratamiento con NIR-PMC, tratamiento con anti-PD-1 (200 μg/ratón dos veces por semana) y cotratamiento con NIR -PMCs y anti-PD-1. La figura 6c muestra el esquema de tratamiento combinado. Como se muestra en la Fig. 6d, se detectó un crecimiento tumoral rápido en ratones portadores de tumores no tratados mediante la luminiscencia intensa de las células 4T1, así como en las imágenes de campo brillante. La rápida proliferación de células de cáncer de mama condujo a una deficiencia de nutrientes y necrosis celular, evidenciada por la disminución de la luminiscencia en los núcleos tumorales. Mientras que el cotratamiento con NIR-PMC y anti-PD-1 mostró un potente efecto terapéutico, los tratamientos con NIR-PMC y anti-PD-1 simplemente suprimieron el crecimiento del tumor en las primeras 2 semanas, pero posteriormente creció rápidamente. Este resultado fue confirmado además por los datos de volumen del tumor. Los tamaños de los tumores en el cotratamiento fueron tres veces más pequeños que los del tratamiento anti-PD-1 (Fig. 6e, Fig. 24 complementaria). También se examinaron metástasis tumorales en pulmones de animales. Como se muestra en la Fig. 6f, mientras que el anti-PD-1 tuvo un efecto limitado sobre las metástasis tumorales, el tratamiento con NIR-PMC redujo significativamente los nódulos tumorales en los pulmones diseccionados. En particular, no hubo metástasis de tumores pulmonares detectables en el grupo de cotratamiento. También comparamos las tasas de supervivencia de los animales en los diferentes tratamientos (Fig. 6g). Todos los animales con tumores no tratados estaban muertos o alcanzaron un estado moribundo en 25 días, mientras que los tratamientos con NIR-PMC o anti-PD-1 prolongaron significativamente la supervivencia de los animales (+40 %). Curiosamente, no se observaron muertes de animales después del tratamiento conjunto durante 50 días, y 8 de cada 10 ratones sobrevivieron durante más de 60 días. En general, estos datos sugirieron que la combinación de implantes de PMC con inhibidores de puntos de control inmunitarios mostró un fuerte efecto sinérgico (IC = 0,23) en ratones con cáncer de mama.

a Imágenes representativas de tinción inmunohistoquímica (CD4, CD39, CD206, CD73 y A2AR) de tumores de mama. b Producción de HIF-1α y adenosina en tumores de mama ortotópicos. Se detectaron HIF-1α o adenosina en lisados ​​tumorales mediante ELISA y LC-MS, respectivamente (n = 6 y 3). Los datos se presentan como la media ± SD. *p < 0,05, ***p < 0,001 en comparación con ratones con cáncer de mama no tratados mediante la prueba t de Student de dos colas. c Ilustración esquemática del tratamiento combinado con NIR-PMC y anti-PD-1. A los 7 días posteriores a la implantación del tumor (tamaño del tumor ~100 mm3), se inyectaron intratumoralmente PMC (25 μL, 3,6 × 104/mL) en ratones con tumores, y luego se sometió a los ratones a radiación NIR de 300 mW/cm2 durante 28 días. Se administró una sola inyección de PMC durante todo el procedimiento de tratamiento del tumor. Cada ratón recibió 10 mg/kg de anti-PD-1 dos veces por semana. d Imagen de bioluminiscencia (BLI) e imágenes de campo claro (BF) de ratones con cáncer de mama. Los animales que recibieron diferentes agentes terapéuticos se sometieron a imágenes de bioluminiscencia por cámara y un sistema de espectro de imágenes IVIS a los 0, 7, 14, 21 y 28 días. e, Curvas de crecimiento tumoral promedio de ratones. El volumen del tumor de ratones individuales se midió con un calibrador Vernier cada 2 días durante 20 días (n = 6). Los datos se presentan como la media ± SD. ***p < 0,001 en comparación con ratones con cáncer de mama no tratados según la prueba t de Student de dos colas. f Imágenes ex vivo de metástasis pulmonar. Los animales que recibieron diferentes tratamientos fueron sacrificados a los 21 días para la visualización de nódulos metastásicos en los pulmones. Los nódulos de metástasis pulmonares se describen con un contorno negro. g Curvas de Kaplan-Meier que muestran las tasas de supervivencia de los ratones indicados a los 60 días (n = 10). Los datos se presentan como ***p < 0,001, en comparación con los datos de conejos portadores de tumores de hepatocarcinoma no tratados según la prueba de rango logarítmico del software estadístico SPSS 17.0. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para evaluar la bioseguridad de NIR-PMC en animales, se administraron PMC a ratones sanos mediante inyección intraperitoneal o subcutánea y se expusieron a radiación NIR. Los tejidos animales se recogieron para exámenes histológicos. Como se muestra en la Fig. 25 complementaria, la tinción H&E mostró cambios patológicos insignificantes en todos los órganos analizados, y la tinción TUNEL no indicó muerte celular necrótica en secciones de piel. Aunque los resultados de los análisis de sangre mostraron cambios limitados de plaquetas sanguíneas, neutrófilos y monocitos en el primer o tercer día después de las inyecciones, todos se recuperaron en el octavo día. Estos resultados demostraron bien la bioseguridad de las PMC (Tabla complementaria 4 y Tabla complementaria 5).

Las estrategias terapéuticas tumorales se basan en nuestra comprensión de los mecanismos de carcinogénesis. Si bien la selección somática a menudo se reconoce como la causa principal de la carcinogénesis, una gran cantidad de investigación se ha dirigido al descubrimiento de quimioterapéuticos o fisioterapéuticos para eliminar las células mutantes7,47. Aunque millones de pacientes con cáncer han prolongado con éxito sus vidas debido a la eliminación de tumores, los efectos secundarios, la resistencia a los medicamentos48 y la metástasis tumoral49 se han convertido en obstáculos formidables. Esto ha requerido un replanteamiento de las estrategias terapéuticas del cáncer. Se han despertado importantes intereses de investigación para mejorar los microambientes de los tumores hipóxicos. Una cámara hiperbárica es una instalación convencional en las clínicas para elevar los niveles de oxígeno en la sangre. Fue descubierto por Joseph Priestley en 1775, pero la primera aplicación terapéutica se realizó en la enfermedad por descompresión 150 años después50. Posteriormente, estas instalaciones también fueron utilizadas para cirugía cardiaca51, enfermedades infecciosas52 y terapias tumorales53. Sin embargo, la baja especificidad para el tejido diana y la pobre eficiencia del oxígeno hiperbárico limitan sus aplicaciones en pacientes con cáncer53. Para superar estas limitaciones, se exploraron portadores de fármacos para suministrar oxígeno específicamente a los tumores. Por ejemplo, Liang et al. diseñó nanopartículas O2@PFOB@PGL, que podrían actuar como reservorios de oxígeno prominentes y administrar oxígeno de manera efectiva a los tumores hipóxicos para mejorar la terapia fotodinámica54. Las nanopartículas a base de platino podrían reaccionar con H2O2 endógeno para generar O2 dentro del sitio del tumor y mejorar el microambiente hipóxico para la terapia combinada55,56. Los perfluorocarbonos (PFC), materiales sintéticos que muestran una alta capacidad de carga de oxígeno, fueron capaces de descargar oxígeno en un microambiente tumoral hipóxico57. Sin embargo, estos enfoques podrían simplemente proporcionar suplementos de O2 transitorios. En este documento, construimos una fábrica inteligente de microoxígeno mediante la encapsulación de UCNP y algas en microcápsulas. A diferencia de la estrategia de suministro de oxígeno informada, los PMC resultantes explotaron los láseres NIR para controlar la fotosíntesis de las algas y permitir suplementos de oxígeno de larga duración. Aunque las NIR se aplican a los animales diariamente, la pO2 en los tumores alcanzó picos (27,2-35,4 mmHg) 1 h después de la exposición NIR y volvió al estado hipóxico (10 mmHg) en 24 h. La suplementación periódica de oxígeno puede afectar la red metabólica y los fenotipos de las células cancerosas, lo que debe considerarse en los estudios de seguimiento. En este sentido, el antagonismo de larga duración de los microambientes hipóxicos en los tumores puede suprimir la duplicación celular y retrasar la progresión tumoral. Nuestros hallazgos en conejos portadores de tumores de hepatocarcinoma respaldaron esta hipótesis, ya que no se incluyeron agentes para matar tumores. En particular, en los diez animales probados, dos conejos estaban libres de cáncer, ya que vivieron cinco veces más (>140 días) que los animales no tratados (tiempo de supervivencia promedio ~27 días) y no tenían nódulos tumorales detectables. Sin embargo, estos hallazgos pueden necesitar más validación en diferentes modelos de tumores.

Aunque la cirugía es la primera opción para el 30-40 % de los pacientes con cáncer en cada etapa temprana (etapa 0) o temprana (etapa I)58,59, las PMC pueden administrarse solas o pueden actuar sinérgicamente con los efectos de la quimioembolización transarterial (TACE) y terapias intervencionistas, inmunológicas y dirigidas en pacientes oncológicos en estadios intermedios o tardíos (>Estadio II) para establecer control local y paliación. Los PMC se diseñaron deliberadamente para acomodar el dispositivo de intervención. Aunque se seleccionó la inyección intratumoral para la administración de PMC en animales, las PMC podrían aplicarse en pacientes humanos mediante quimioembolización arterial transcatéter. Para facilitar futuras aplicaciones clínicas, la dosis y el tiempo de duración de la radiación NIR deben examinarse cuidadosamente. Tomando como ejemplo el hepatocarcinoma, se aplicó radiación NIR de 900 mW/cm2 a 980 nm a conejos durante 60 min/día. Dado que la profundidad del hepatocarcinoma en conejos es de 0,3 a 0,7 cm, el tumor recibió una radiación de 300 a 500 mW/cm2 después de la penetración en el vientre del animal60. Para adquirir tal intensidad de excitación en pacientes humanos, la dosis de radiación debe aumentarse a 2000 mW/cm2 o el tiempo de duración debe extenderse a 180 min porque el hepatocarcinoma en pacientes humanos suele ser más profundo que en conejos61,62,63 y porque la intensidad de la radiación NIR a 980 nm disminuiría a <30 % después de la penetración de 0,7 a 1,0 cm de tejido abdominal en humanos. Sin embargo, esta cantidad de radiación NIR puede inducir daños por hipertermia. Alternativamente, la radiación NIR-II a 1200-1700 nm sería más adecuada para aplicaciones clínicas, ya que los fotones NIR-II tienen una capacidad de penetración mucho más profunda que los láseres NIR a 980 nm64. Los UCNP con excitaciones en la región NIR-II podrían explotarse para construir PMC para aplicaciones potenciales en clínicas. Dado que la terapia intervencionista es un tratamiento convencional en pacientes con hepatocarcinoma, las PMC son un implante prometedor para aplicaciones clínicas.

Además del modelo de hepatocarcinoma, examinamos los efectos de las PMC en ratones con cáncer de mama. Se examinaron exhaustivamente los efectos de los diferentes constituyentes de las PMC. De acuerdo con los resultados in vitro (Fig. 3b), los efectos terapéuticos se observaron principalmente en animales que recibieron tratamiento con NIR-PMC (Fig. 26 complementaria y Fig. 27 complementaria). La biodistribución de las PMC en los tumores se examinó mediante la observación visual de la luminiscencia, y sus ubicaciones tuvieron pocos cambios (Fig. 28 complementaria). Se ha informado que el oxígeno activa respuestas inmunitarias antitumorales, como la diferenciación de macrófagos asociados a tumores M2 (TAM) a M165 y la activación de células T66 y células NK mediante la síntesis de radicales superóxido67. Hatfield et al. propusieron eliminar el eje hipoxia/HIF-1α/adenosina/A2AR mediante agentes oxigenantes para mejorar la inmunoterapia del cáncer o sinergizar otros tratamientos oncológicos31,44. Nuestro estudio demostró que las NIR-PMC podrían mejorar significativamente el estado de hipoxia e inhibir la producción de HIF-1α y adenosina en esferoides de células cancerosas y tumores de mama. Además, la hiperoxia por NIR-PMC podría revitalizar la función efectora de las células T y NK en términos de producción de IFN-γ y capacidad citolítica in vitro. Los tumores tratados con NIR-PMC mostraron una expresión más baja de A2AR pero una expresión mejorada de CD4, lo que sugiere la aparición de una respuesta inmunitaria anticancerígena mejorada en los tumores de mama. La combinación de NIR-PMC con inhibidores de puntos de control inmunitarios mostró beneficios de supervivencia considerables en ratones con tumores de mama. Estos resultados apoyaron fuertemente la estrategia terapéutica propuesta por Hatfield et al.

La metástasis tumoral es un proceso complejo que implica la diseminación del cáncer; transición epitelial-mesenquimatosa; e invasión por migración colectiva, circulación de células cancerosas, interacción con células inmunitarias, colonización metastásica, etc. Recientemente se descubrió que algunas biomoléculas, incluidas FAT168, proteínas ribosómicas69, la proteína transmembrana CCDC2570, Nrf271 y E-cadherina72, regulan la progresión de la metástasis. Además, como factor microambiental potente, se informó que la hipoxia promueve múltiples pasos (p. ej., invasión, migración, intravasación y extravasación) dentro de la cascada metastásica1. Aunque la metástasis tumoral es la principal causa de fracaso del tratamiento en pacientes con cáncer y es responsable del 90% de la mortalidad relacionada con el cáncer73, existen pocas intervenciones clínicas. Sin embargo, la fábrica de oxígeno in vivo construida en este estudio podría explotarse potencialmente en tratamientos contra el cáncer para suprimir la metástasis tumoral. Los implantes de PMC previnieron drásticamente la metástasis tumoral en modelos de cáncer de mama ortotópico y hepatocarcinoma trasplantado. Los microambientes hiperóxicos creados por las PMC NIR pueden bloquear la invasión de células cancerosas al antagonizar las señales de metástasis74.

En resumen, construimos con éxito fábricas de oxígeno (PMC) encapsulando cianobacterias y UCNP en microcápsulas de alginato-polilisina. Los PMC permitieron la fotosíntesis bajo radiación NIR y proporcionaron una oxigenación controlable y duradera en contextos biológicos. El O2 suplementado por las PMC inhibió la producción de HIF-1α y la activación de NF-κB en las células cancerosas y evitó drásticamente la duplicación de células cancerosas de una manera no tóxica. Se crearon microambientes hiperóxicos in vivo mediante implantes de PMC en hepatocarcinoma ortotópico y tumores de mama y se inhibió significativamente el crecimiento tumoral y la metástasis. Se demostró un potente efecto sinérgico en el cáncer de mama de ratones que recibieron cotratamiento con implantes de PMC y un inhibidor de puntos de control (anti-PD-1). En general, nuestros hallazgos demostraron el efecto supresor del microambiente hiperóxico sobre la progresión del tumor.

Los anticuerpos para Western-blot en este estudio, incluidos anti-fosfo-IκBα (Cat. 9246), anti-IκBα (Cat. 4814), se adquirieron de Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, EE. UU.). 3-metiladenina (HY-19312), MK-2206 (HY-10358), rapamicina (HY-10219) y PD98059 (HY-12028) e IL-2 (HY-P7077) se adquirieron de MedChemExpress (Nueva Jersey, EE. UU.) . Poli-L-lisina (MW: 15000-30000, P4832), BMS-345541 (Cat. 401480), PMA (P1585) y Anti-β-actina anticuerpo (A2066) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo , EE.UU). Anti-PD-1 se adquirió de BioXCell (BE0146, Líbano, EE. UU.). Los kits de ensayo MTS se adquirieron de Promega (Madison, WI, EE. UU.). Penicilina, estreptomicina, tripsina-EDTA y medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y medio RPMI-1640 se adquirieron de Hyclone Laboratory (South Logan, Utah, EE. UU.). Anti-AKT (bsm-33278M) se adquirió de Bioss (Beijing, China). Anti-PI3K (AF6241), anti-fosfo-PI3K (AF3242) se adquirieron de Affinity Biosciences (EE. UU.). Insulina, Hoechst 33342, lisado RIPA, DCF-H, kit de ensayo SYBR Green, kit de tinción LIVE/DEAD y kit de ensayo Click-iT®EdU-594 se adquirieron de Thermo Fisher Scientific (Grand Island, NY, EE. UU.). Proteína recombinante TNF-α (ab9642), EGF (ab9697), anti-fosfo-AKT (ab38449), anti-mTOR (ab134903), anti-fosfo-mTOR (ab109268), anti-ERK (ab32537) y anti-fosfo- ERK (ab214036) se adquirió de Abcam (Shanghai, China). 5-FU (F100149) se adquirieron de Aladdin (Shanghai, China). El kit de tinción HIF-1 alfa se adquirió de R&D (Minnesota, EE. UU.). El inhibidor de Golgi (Cat. 554724), el tampón Cytofix/Cytoperm (Cat. 554722), el tampón Perm/Wash (Cat. 554723) y el anti-IFN-γ-FITC (Cat. 554411) se adquirieron de BD (Biosciences, Bedford, MA ). El anticuerpo anti-CD28 de ratón (Cat. 102102) y el anticuerpo anti-CD3 de ratón (Cat. 100302) se adquirieron de Biolegend (Shanghai, China). El kit HypoxyprobeTM-1 Plus se adquirió de HPI Inc. (Burlington, MA, EE. UU.). El kit de ensayo de muerte celular apoptótica de anexina V-FITC/PI (abs50001) fue de Absin Bioscience Inc (Shanghai, China). IL-15 (CLY200-07AF) se adquirió de Cedarlane (Canadá). El clorhidrato de xilacina se adquirió de Shengda Animal Products Co., Ltd (Jilin, China). La membrana de PC Transwell-24 (Cat. 3422) y Matrigel Matrix se adquirieron de Corning (Nueva York, EE. UU.). El medio de cultivo de células Blue Green Algal (BG-11) se adquirió del Instituto de Hidrobiología (Wuhan, China). El alginato de sodio (peso molecular, 460 kDa; proporción molar de ácido manurónico a ácido gulurónico, 2/1) se adquirió de Qingdao Bright Moon Seaweed Group Co., LTD (Qingdao, China). Las nanopartículas de conversión ascendente (NaYREF4, RE: Yb, Er@NaYF4) se sintetizaron de acuerdo con un método informado75. Todos los demás reactivos fueron de grado analítico.

Synechocystis sp natural. 6803 (n° de catálogo FACHB-898), Synechococcus elongates 7942 (n° de catálogo FACHB-805), Scenedesmus obliquus (n° de catálogo FACHB-417) y Chlorella ellipsoidea (n° de catálogo FACHB-40) adquiridos del Instituto de Hidrobiología ( Wuhan, China) se sometieron a una evolución selectiva para la aclimatación de las condiciones fisiológicas mediante alternancias escalonadas de las condiciones de crecimiento, incluida la temperatura (25–37 °C) y la composición del medio (BG11 a DMEM). La temperatura de cultivo y las composiciones de los medios se cambiaron gradualmente para permitir la evolución de los microbios para sobrevivir en condiciones fisiológicas76,77,78. En detalle, se dispersaron 3 ml de microbios de algas en fase estacionaria (1,0 × 108 células/ml) en 10 ml de medio BG11 en matraces con fondo deflector y tapas ventiladas (n.º de catálogo 4116-0125, Thermo Fisher Scientific Inc.) en un agitador para cambio gradual de la condición de cultivo. Como control se utilizaron microbios de algas cultivados a 25 °C. La proliferación celular se calculó utilizando la ecuación. (1) detectando el valor de densidad óptica a 660 nm (OD660):

Donde VAT y VmT son los valores OD660 de microbios de algas y medios de cultivo, respectivamente, en las condiciones probadas; VA y VM son los valores OD660 de microbios de algas y medio BG11, respectivamente, en condiciones de cultivo normales (25 °C).

Una vez que las células se adaptaron a la temperatura probada y mostraron una proliferación celular >85%, aumentamos la temperatura de cultivo (1 °C). De lo contrario, mantuvimos la temperatura durante otras 24 h. Después de 30 días de cultivo, los microbios de algas evolucionados se adquirieron y conservaron en medio BG11 a 37 °C para pruebas posteriores. A continuación, repetimos el procedimiento anterior cambiando paso a paso la composición del medio de BG11 a DMEM. El evolucionado Synechocystis sp. 6803 cultivado a 37 °C en DMEM se denominó eS. sp. 6803.

eS. sp. 6803 se recogió por centrifugación a 1000 × g durante 10 min (Centrifuge 5810 R, Eppendorf) en tubos de 50 ml y se resuspendió en PBS para la construcción de PMC. Las células suspendidas se mezclaron con UCNP a las concentraciones deseadas en soluciones de alginato de sodio al 1,5% en peso. Después del vórtice, la mezcla se extruyó a través de una aguja de 0,5 mm en una solución de CaCl2 0,1 M (baño de gelificación) con un generador de gotas electrostáticas para preparar perlas de alginato-Ca. Las perlas se empaparon en una solución de polilisina al 0,05 % en peso (relación de volumen de 1:10) durante 10 minutos para formar un revestimiento de polilisina. Las microcápsulas recubiertas se suspendieron en 5 ml de PBS y se contaron al microscopio. Todos los PMC recién hechos se cultivaron en la incubadora de iluminación (HerryTech KE-200, Shanghai, China) a 37 ° C para usos posteriores.

La morfología y el tamaño de las PMC se determinaron mediante microscopía (FV1200, Olympus, Tokio, Japón). MC vacíos, eS. sp. Se agregaron 6803@MC y PMC a 3600/ml en una cámara de ocho pocillos para evaluar las actividades de fotoluminiscencia mediante un microscopio confocal de conversión ascendente con un objetivo de 20x a una excitación láser de 980 nm. Los espectros de fotoluminiscencia de los UCNP se midieron con un analizador fluorimétrico Edingbour NanoSpectralyzer (Applied NanoFluorescence, FLS980). Para adquirir el perfil de liberación de oxígeno, se suspendieron PMC recién preparadas a 3600/mL en 10 mL de agua libre de oxígeno que se sometió a 1 hora de extracción al vacío (1,45 × 10−3 psi) con reflujo de CO2. Las suspensiones de PMC (10 mL) en tubos Eppendorf transparentes se expusieron a radiación de 980 nm a 0, 100, 300, 900 mW/cm2 durante 0–60 min. Se aplicó un medidor de oxígeno disuelto portátil (sensor de oxígeno JPB-70A, Qiwei Instrument Co., Ltd. Hangzhou, China) para registrar las concentraciones de oxígeno disuelto. Las suspensiones que contenían UCNP@MC también se incluyeron en blanco.

Las células HCT116, HepG2, VX2, MCF-7, PANC-1, MGC-803, 4T-1, HeLa y A549 se adquirieron de ATCC (EE. UU.). El análisis STR se realizó para autenticar la célula HeLa en nuestro estudio. Los loci STR se amplifican utilizando cebadores de PCR marcados con fluorescencia que flanquean las regiones hipervariables. El resultado mostró que la célula HeLa utilizada en nuestro estudio coincidía con HeLa en ATCC (Tabla complementaria 6). Las células Yac-1 se adquirieron de la Colección Nacional de Células Autenticadas (Shanghai, China). Las células MEF (fibroblastos embrionarios de ratón) fueron donadas por el Dr. Sudan He (Instituto de Medicina de Sistemas de Suzhou, Academia China de Ciencias Médicas, China). Se adquirieron células primarias de corazón y riñón de ratones BALB/c. En detalle, el corazón y el riñón de ratón disecados se cortaron en trozos pequeños (<3 mm), se lavaron lo suficiente con PBS frío (4 °C) para eliminar las células sanguíneas y se transfirieron a tubos de disociación que contenían 5 ml de soluciones de trabajo de kits de disociación de corazón o riñón ( Bio-leader Inc, Jiangxi, China). Los tubos se fijaron en la manga de un disociador de tejidos (Bio-leader Inc, Jiangxi, China) durante 1 min de trituración a 100 g (30 s encendido, 30 s apagado), seguido de 60 min de digestión enzimática a 37 °C. Las suspensiones celulares se recogieron por filtración (70 μm). Los sedimentos de células de corazón y riñón se contaron y se resuspendieron en medios de cultivo celular. Todas las líneas celulares se cultivaron en medio DMEM o medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Gemini, Woodland, EE. UU.), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina a 37 °C, 5 % de CO2 o en condiciones hipóxicas ( 2% O2 y 5% CO2).

Las células analizadas se sembraron en placas de 96 pocillos a 5 × 103/pocillo para una incubación durante la noche, seguido de la adición de 25 μL de PBS, MC vacíos, UCNP@MC y PMC (25 μL, 3,6 × 104/mL). Las células y las PMC se cultivaron en una atmósfera hipóxica humidificada con 2 % de O2 y 5 % de CO2 a 37 °C durante 24 h con o sin radiación NIR de 300 mW/cm2 durante tres intervalos. Después de eliminar los sobrenadantes y las PMC residuales, se agregaron alícuotas de 120 μL de solución de trabajo de MTS diluida a cada pocillo y se incubaron a 37 °C durante 2 h más. Los sobrenadantes se transfirieron a placas nuevas (100 μl/pocillo) para la detección de absorbancia a una DO de 490 nm mediante un lector de microplacas (Synergy NEO HTS, Biotek, EE. UU.). La viabilidad celular se determinó mediante la ecuación. 2:

donde AN, AC y AB representan la absorbancia del sustrato MTS a 490 nm en células tratadas, no tratadas y muestras en blanco, respectivamente.

Las células NK clasificadas (2 × 105 células/pocillo) se cocultivaron con células fLuc-Yac-1 (linfoma de ratón) en proporciones de 1:1 o 2:1 en presencia o ausencia de PMC, seguido de tres intervalos de la exposición NIR. Después de la incubación durante 6 h, las mezclas de células se recolectaron para lisar las células Yac-1 con 100 μL de tampón de lisis Glo (Cat. E266A, Promega, WI, EE. UU.). Después de eso, se agregaron 50 μl/pocillo del sistema de ensayo de luciferasa One-Lite® (Cat. DD1203-01, Vazyme, Nanjing, China) para medir la luminiscencia de los lisados ​​celulares en un lector de microplacas. Se midió la luminiscencia de las células Yac-1 para determinar los porcentajes de muerte celular que se utilizaron para evaluar la actividad citolítica de las células NK79. El porcentaje de muerte celular se determinó mediante la Eq. 3:

donde Io e Ilysate representan la intensidad de luminiscencia del lisado celular en células no tratadas y cocultivadas con células NK, respectivamente.

Matrigel Matrix (1,5 ml) se descongeló en un baño de hielo a 4 °C y se mezcló con 0,5 ml de suspensiones de células HepG2 o MCF-7 (4 × 106 células/ml en DMEM preenfriado). Las soluciones se mezclaron suavemente para evitar la generación de burbujas de aire. Se agregaron alícuotas de suspensiones de 300 μl en placas de 24 pocillos preenfriadas o placas confocales de 35 mm. Las placas o placas se cultivaron a 37 °C durante 30 min para polimerizar la matriz, seguido de la adición de 1 ml de DMEM en la parte superior del gel en cada pocillo/placa para cultivo adicional. Se adquirieron esferoides de células cancerosas maduras después de un cultivo de 7 a 10 días una vez que los tamaños de los aglomerados celulares son > 50 μm.

Los esferoides tratados en placas de 24 pocillos se licuaron en hielo mediante la solución de recuperación de células (BD Biosciences, Bedford, MA). Los esferoides celulares se recolectaron por centrifugación a 500 × g durante 5 min, se lavaron con PBS y se lisaron en PBS (50 μL) mediante tres ciclos repetidos de congelación y descongelación en nitrógeno líquido. Se pesaron los tumores frescos y se disociaron muestras de 50 mg en 100 μL de PBS a 4 °C mediante un homogeneizador (OSE-Y30, TIANGEN, China). Las soluciones de tejido homogeneizado y los lisados ​​​​celulares se centrifugaron a 500 × g durante 5 min para eliminar los desechos. Las concentraciones de proteína en los sobrenadantes se detectaron mediante el ensayo de Bradford. Los lisados ​​​​se almacenaron a -20 ° C para el análisis de adenosina o citoquinas.

Se utilizó un equipo láser (Xi'an Lei Ze Electronics Tech Co., Ltd, Shanxi, China) para proporcionar radiación NIR para impulsar la fotosíntesis en PMC mediante un láser de 980 nm a 0–900 mW/cm2. Las PMC en medios de 10 ml (PBS, BG11 o DMEM) se colocaron en tubos Eppendorf transparentes y se expusieron a láser NIR de 100–900 mW/cm2 durante 0–60 min. Las células y los esferoides cultivados en placas multipocillo o placas confocales se expusieron a radiación NIR de 300 mW/cm2 durante tres intervalos (20 min para cada intervalo, 15 min encendido y 5 min apagado). Se expuso a ratones y conejos portadores de tumores a tres intervalos (20 min para cada intervalo, 15 min encendido y 5 min apagado) de radiación NIR de 300 mW/cm2 y 900 mW/cm2 cada día, respectivamente.

Para visualizar la generación de oxígeno en PMC, se utilizó el kit de tinción DCFH para visualizar la generación de oxígeno. PMC, es. sp. Se cultivaron 6803@MC y UCNP@MC a 1500/pocillo en 1 ml de medio DMEM en una placa confocal de 35 mm durante 12 h en la oscuridad a 37 °C. Luego, las PMC tratadas se incubaron con 10 μg/mL de DCFH durante 10 min y luego se expusieron a 300 mW/cm2 de radiación NIR de 980 nm durante 0, 1, 3 y 10 min. La fluorescencia de DCF se visualizó inmediatamente mediante microscopía confocal a una excitación de 488 nm.

Para evaluar el estado hipóxico, se cultivaron esferoides de células maduras HepG2 y MCF-7 en placas confocales de 35 mm con 1 ml de DMEM fresco con o sin suspensiones de PMC (4500/ml en DMEM). Luego, los esferoides se expusieron a una radiación NIR de 300 mW/cm2 durante tres intervalos. Posteriormente, los esferoides se incubaron con Clorhidrato de Pimonidazol 100 μM durante 12 h a 37 °C, se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente. Las células en los esferoides se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % en PBS durante 1 h y se tiñeron con 0,5 μg/mL de FITC conjugado con anticuerpo monoclonal IgG1 de ratón (FITC-MAb1) en PBS durante 6 h y 10 μg/mL de Hoechst 33342 en PBS a temperatura ambiente durante 30 min. Las células teñidas se lavaron con PBS tres veces para obtener imágenes microscópicas a longitudes de onda de excitación de 405 nm y 488 nm.

Para obtener nuevas imágenes de células hijas, las células HepG2 y MCF-7 pretratadas con o sin PMC de 4500/ml se expusieron a tres intervalos de radiación NIR. Las células tratadas se incubaron con 1 ng/ml de TNF-α durante 12 horas o BMS 40 μM durante 12 horas. Después de eso, los sobrenadantes se reemplazaron por 500 μL de solución de trabajo EdU (10 μM) en un kit de ensayo Click-iT®EdU-594. Después de 2 h adicionales de cultivo a 37 °C, las células se fijaron con formaldehído al 4 % durante 30 min a temperatura ambiente y se permeabilizaron en Triton X-100 al 0,5 % en PBS durante 20 min. Después de retirar los sobrenadantes y lavar tres veces con BSA al 3 %, se preparó recientemente el cóctel de reacción click que contenía 860 μl de tampón de reacción, 40 μl de CuSO4, 2 μl de azida 594 y 100 μl de solución de aditivo click y se añadió a las células permeabilizadas. Después de 30 min de reacción a temperatura ambiente, se eliminó el cóctel de reacción. Las células se lavaron dos veces con BSA al 3 % en PBS y se incubaron con 0,5 ml de Hoechst 33342 (10 μg/ml) para la tinción del núcleo. Después de 10 min de incubación, las muestras de células marcadas se visualizaron mediante microscopía confocal (FV1200, Olympus, Japón)

Las células HepG2 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 6 × 105 células/pocillo. Después de la incubación durante la noche, las células se expusieron a tres intervalos de radiación NIR en presencia o ausencia de 1,2 × 104/mL de PMC, seguido de incubaciones con TNF-a (200 ng/mL), EGF (200 ng/mL) e insulina ( 100 nM) durante 10 min. Después de eso, los sobrenadantes se reemplazaron con medios nuevos o medios que contenían inhibidores para incubaciones posteriores, incluido BMS 20 µM durante 2 h, 3-metiladenina 2 mM durante 1 h, MK-2206 4 µM durante 4 h, rapamicina 100 nM durante 4 h o PD98059 100 μM durante 2 h. Después de un lavado suficiente con PBS, los sedimentos celulares se recogieron y se suspendieron en tampón de lisis (glicerol al 10 %, Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Na3VO4 1 mM, Triton X-100 al 1 %, β-glicerol 25 mM). fosfato, fluoruro de fenilmetanosulfonilo 0,1 mM) con inhibidores de fosfatasa combinada al 2 % (Cat: P5726, Sigma) y proteasa al 5 % (Cat: P5147, Sigma). Las suspensiones celulares se agitaron durante 10 s y luego se incubaron en hielo durante 30 min, seguido de centrifugación a 2000 × g durante 20 min. Las concentraciones de proteína en los sobrenadantes se determinaron y ajustaron mediante el ensayo de Bradford. Las muestras se separaron en gel SDS-PAGE al 8–15 % (Beyotime, Shanghái, China) usando tampón tris-glicina-SDS como tampón de ejecución en el sistema Mini-PROTEAN Tetra (Bio-Rad, CA, EE. UU.) a 100 V y transferido a una membrana de nitrocelulosa a 300 mA. Las membranas se bloquearon con leche al 5 % (Biofrox, Einhausen, Alemania) en Tween 20 al 0,1 %/PBS a temperatura ambiente durante 2 h y luego se incubaron con IκBα (1:1000), IκBα fosforilado (1:1000), PI3K ( 1:500), PI3K fosforilada (1:500), AKT (1:1000), AKT fosforilada (1:1000), mTOR (1:10000), mTOR fosforilada (1:10000), ERK (1:1000), ERK fosforilada (1: 1000) y β-actina (1: 5000) anticuerpos durante la noche a 4 ° C. Después de tres lavados con Tween 20 al 0,1 % v/v en TBS (tampón de lavado) e incubación con anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:5000) durante 2 ha temperatura ambiente, las membranas se lavaron suficientemente. La solución de quimioluminiscencia hipersensible ECL recién preparada se usó para obtener imágenes de las membranas mediante un sistema de análisis de imágenes de quimioluminiscencia de fluorescencia multicolor (FluorChem M, Alpha, EE. UU.).

Los lisados ​​​​de muestra de esferoides (50 μL) y tumor (100 μL) que constaban de 0.1–0.4 mg de proteínas se mezclaron con 1 mL de metanol preenfriado y se incubaron a -20 ° C durante 16 h. La mezcla se centrifugó a 20 000 × g durante 10 min a 4 °C para eliminar los precipitados de proteínas. Los metabolitos de los sobrenadantes se secaron con N2 en un concentrador de soplado de gas a presión (VSD150-2, Woxin Instrument Manufacturing Co., China) y se volvieron a disolver en 150 μL de tampón A (0,1 % de ácido fórmico en agua DI). También se prepararon estándares de adenosina disueltos en tampón A a 0–1000 nM. Se inyectaron alícuotas de muestras de 5 μL y se separaron en una columna de fase reversa C18 (2,1 mm × 150 mm, 100 Å, 3,5 μm). El análisis LC-MS se realizó en un sistema LC Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) junto con un espectrómetro de masas LTQXL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). La fase móvil fue programada por un sistema isocrático que consiste en 70% tampón A y 30% tampón B (100% ACN). El caudal se mantuvo a 300 μL/min. La detección MRM MS se operó en modo de ionización positiva para recopilar datos. La detección de MS se realizó con un voltaje de fuente de 3 kV y una temperatura capilar de 350 °C. Los caudales de gas envolvente y auxiliar se fijaron en 55 arb y 15 arb, respectivamente. Los datos de MS se analizaron mediante el software Xcalibur. Las concentraciones de adenosina en las muestras analizadas se determinaron mediante su curva estándar.

Para examinar si el tratamiento con NIR-PMC indujo muertes celulares apoptóticas, se sembraron células HepG-2 (5 × 105 células/pocillo) en placas de seis pocillos y se cultivaron en DMEM durante 16 h. Luego, los sobrenadantes se reemplazaron por medio fresco o DMEM que contenía 500 µg/ml de 5-FU o PMC a 3600/pocillo y se expusieron a NIR durante tres intervalos. Después de 24 h de incubación, las células se recolectaron y tiñeron con un kit de tinción de Anexina V-FITC/PI de acuerdo con el protocolo del fabricante antes del análisis de citometría de flujo.

Se realizó un ensayo de tinción intracelular para examinar el efecto del tratamiento con NIR-PMC sobre la producción de células T con IFN-γ. Células T de ratón preactivadas con anticuerpos CD3 y CD28 se resuspendieron en RPMI-1640 complementado con FBS al 10 % y luego se sembraron en las cámaras inferiores de placas de 24 transwell (2 × 106 células/pocillo, 2 ml) con 50 ng/ml PMA y 1 µL/mL de inhibidor de Golgi. Se añadieron PMC a la cámara superior (3600/pocillo) con un tamaño de poro de 8,0 µm en membranas de PC. Luego, los cultivos completos se expusieron a radiación NIR de tres intervalos. Después de 18 h, las células se centrifugaron a 700 g durante 5 min y las células sedimentadas se fijaron en tampón BD Cytofix/Cytoperm durante 30 min. Las células fijadas se lavaron con BD Perm/Wash buffer (Cat. 554723, BD Biosciences) una vez, y luego las células se resuspendieron en BD Perm/Wash buffer que contenía 5 µL/prueba de anti-IFN-γ-FITC (Cat. 554411, BD Biosciences) para incubación a temperatura ambiente durante 30 min. Después de tres lavados en tampón BD Perm/Wash, las células resuspendidas se sometieron a análisis de citometría de flujo (FACSVerse, BD). El análisis de datos se llevó a cabo utilizando el software FlowJo (Tree Star Inc.)

Se obtuvieron ratones hembra BALB/c (6 a 8 semanas de edad, ~20 g) del Experimental Animal Center of the Gempharmatech Co. Ltd en Nanjing, China. Se obtuvieron conejos blancos hembra de Nueva Zelanda (6 meses de edad, con un peso de 2 a 2,5 kg) de Qingdao Kangda Rabbit Co., Ltd. (Qingdao, China). Todos los animales se criaron en una instalación para animales en condiciones de aire filtrado (22–25 °C), ciclo de luz/oscuridad de 12 h (8:00-20:00 luz; 20:00-8:00 oscuridad) y humedad relativa ( 40–70%) en jaulas de plástico con virutas de madera esterilizadas como ropa de cama. Todos los experimentos con animales se realizaron estrictamente bajo las pautas del Consejo Chino para el Cuidado de Animales aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de los Animales de Laboratorio en la Universidad de Soochow (No. ECSU- 202109A0401). Los criterios de valoración humanitarios aprobados se aplicaron a los animales con tumores una vez que cumplieron uno de los siguientes criterios: (i) el diámetro del tumor es >2 cm para ratones o el volumen del tumor es >80 cm3 para conejos; (ii) el comer, beber o el movimiento de los animales se ve gravemente afectado. Para desarrollar los tumores VX2 hepáticos en conejos, se implantaron suspensiones de células VX2 (2 × 106 células, 200 μL) en los músculos del muslo de conejos donantes. Una vez que el tamaño del tumor fue > 2 cm (~2 semanas), los conejos donantes se anestesiaron mediante inyección intravenosa a una dosis letal de 2 ml/kg de clorhidrato de xilazina para la recolección de tejidos tumorales. Cada tumor se desmenuzó en piezas de 1 mm3 con tijeras oftálmicas en condiciones estériles. Los conejos receptores fueron anestesiados mediante inyección intramuscular de clorhidrato de xilazina (250 μL/Kg). Un fragmento de tejido triturado se administró directamente por vía percutánea en el parénquima subcapsular del lóbulo hepático izquierdo del conejo receptor mediante una técnica de punción percutánea bajo la guía de una tomografía computarizada en espiral de 16 cortes (Brilliance-16, Phillips, EE. UU.). Los conejos se alojaron y examinaron mediante imágenes de TC hasta que los volúmenes del tumor alcanzaron alrededor de 1 cm3. Los conejos portadores de hepatocarcinoma con tamaño de tumor similar se dividieron en dos grupos lanzando dados, incluido el control del vehículo (n = 13), grupo NIR-PMC (n = 13). Los conejos se anestesiaron para una única inyección intratumoral de suspensiones de PMC (500 µl, 3,6 × 104/ml) a los 14 días. Las radiaciones NIR a 900 mW/cm2 se expusieron a los animales durante tres intervalos (20 min en cada intervalo) cada día. El tamaño del tumor se controló mediante tomografía computarizada (MHCT Brilliance 16, Philips, Holanda) cada 2 semanas.

Las células fLuc-4T1 donadas por el Dr. Zhimou Yang (Universidad de Nankai, Tianjin, China) se suspendieron en 100 μL de PBS a 2 × 108 células/mL y se inyectaron en las almohadillas de grasa mamaria de cada animal. Los volúmenes tumorales se examinaron cada 2 días y se calcularon mediante la ecuación. 4:

Los ratones inoculados con células 4T-1 se recolectaron para tratamientos posteriores una vez que el tamaño del tumor alcanzó ~50 mm3. Todos los animales calificados se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos lanzando dados para los siguientes tratamientos, incluida la inyección intratumoral de 25 μL de solución salina (vehículo Ctrl), inyección intratumoral de 3,6 × 104/mL de PMC en 25 μL de solución salina junto con 300 mW/cm2 NIR -radiación durante tres intervalos (15 min en cada intervalo) por día (grupo NIR-PMC), inyección intravenosa de 10 mg/Kg anti-PD-1 (100 μL, dos veces por semana) (grupo anti-PD-1), y cotratamiento por NIR-PMC y anti-PD-1 (grupo de cotratamiento). En particular, los animales en los grupos de PMC, NIR-PMC y cotratamiento simplemente inyectaron intratumoralmente con PMC en el séptimo día. Para el tratamiento combinado de cáncer de mama mediante implantes de PMC e inmunoterapia en ratones, el procedimiento de tratamiento animal detallado se ilustró en la Fig. 5b. El índice de combinación (IC) de hiperoxia (300 mW/cm2 NIR durante tres intervalos) y 10 mg/Kg de anti-PD-1 (100 μL, dos veces por semana) se calculó de acuerdo con una fórmula informada:

Donde AB, A y B son los volúmenes tumorales en NIR-PMC, anti-PD-1 y cotratamientos, respectivamente. CI > 1 indica antagonismo, CI = 1 indica aditividad y CI < 1 indica sinergia. Se tomaron imágenes de los tumores con el sistema de espectro de imágenes IVIS (PerkinElmer, ME, EE. UU.) y una cámara Canon (Japón). Los ratones se anestesiaron por completo con una sobredosis de pentobarbital sódico (400 mg/kg) y se sacrificaron para recolectar tumores y pulmones. Las muestras de tejido se almacenaron en nitrógeno líquido para mediciones de citoquinas y adenosina o se fijaron para tinción con H&E o inmunotinción de la expresión de A2AR, CD4, CD39, CD206 y CD73.

Ratones portadores de cáncer de mama con volúmenes tumorales de ~50 mm3 se dividieron aleatoriamente en cinco grupos lanzando dados para los siguientes tratamientos, incluida la inyección intratumoral de 25 μL de solución salina (vehículo Ctrl), recibiendo oxígeno hiperbárico al 60 % durante 1 h (grupo hiperbárico O2) , inyección intratumoral de 3,6 × 104/mL de PMC en 25 μL de solución salina (grupo PMC), inyección intratumoral de 3,6 × 104/mL de microesferas vacías en 25 μL de solución salina junto con una exposición NIR de 300 mW/cm2 cada día (grupo NIR) e intratumoral inyección de 3,6 × 104/mL de PMC en 25 μL de solución salina junto con una exposición NIR de 300 mW/cm2 cada día (grupo NIR-PMC). Se incluyeron tres animales en cada grupo. Las presiones parciales de oxígeno (pO2) en los tumores se detectaron a diferentes profundidades mediante un sensor Clark (0,4 mm de diámetro) en un monitor de pO2 (POG-203, Unique Medical, Tokio, Japón) a 110 V según protocolo del fabricante.

Para la preparación de esplenocitos, se sacrificaron ratones BALB/c (edad: 6–8 semanas; peso: 20 g) mediante inhalación de CO2 para recolectar bazos. Los bazos se trituraron en 10 ml de medio RPMI 1640 (suero bovino fetal al 10 %, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 µg/ml). La mezcla se filtró mediante una membrana de nailon de malla 200 (Cat. 7061011, Dakewe, China) para eliminar los restos de tejido. Las suspensiones se centrifugaron (Allegra 64 R, Beckman) a 500 × g durante 5 min para recolectar sedimentos celulares, seguido de dos lavados en PBS. Los sedimentos celulares se dispersaron y se incubaron en 5 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos 1x RBC (8,26 g/l NH4Cl, 1 g/l KHCO3 y 0,037 g/l EDTA en DI H2O) a temperatura ambiente durante 5 min. Posteriormente, se agregaron medios RPMI-1640 (5 ml) para detener la reacción de lisis y se centrifugaron para recolectar los esplenocitos, que se usaron para la expansión de células T y células NK como se describe a continuación.

Para la expansión de las células T, los anticuerpos de activación anti-ratón CD28 y CD3 se disolvieron en PBS en CD3 y se añadieron a placas de 6 pocillos (1,5 ml/pocillo) para tratar las superficies de los pocillos a 4 °C durante 12 h. Posteriormente, se descartaron las soluciones de anticuerpos de cada pocillo y las placas recubiertas quedaron listas para la expansión de células T a partir de esplenocitos de ratón. Los esplenocitos que se prepararon como se describió anteriormente se resuspendieron en medio RPMI-1640 a 2 × 106/mL, se agregaron a las placas recubiertas con anticuerpos CD28/CD3 (5 mL/pocillo) y se incubaron durante 48 h en presencia de 200 UI/ mL IL-2 para expansión de células T. Luego, las células T preactivadas se recogieron y transfirieron a placas de 24 pocillos (2 × 106/ml, 2 ml/pocillo) para realizar más pruebas de producción de IFN-γ.

Para la expansión de células NK, los esplenocitos (2 × 106/ml, 5 ml/pocillo) se añadieron en placas de seis pocillos en presencia de 20 ng/ml de IL-15 de ratón y 1000 UI/ml de IL-2 de ratón. Los medios celulares se cambiaron cada 2 días. Después de 7 días, las células resultantes se marcaron con 1 μL/1 × 106 células anti-CD3-APC (Cat. 30041, Biolegend) y 1 μL/1 × 106 células anti-NK1.1-PE (Cat. 557391, BD Biociencias) durante 30 min. Las células teñidas se recogieron para separar las células NK1.1+CD3-NK utilizando un clasificador de células de flujo (FACSMelody, BD). Las células NK clasificadas se transfirieron a placas de 24 pocillos para realizar más pruebas de actividad citolítica.

Se agregaron tumores de conejo (20–30 mg) en tubos de suspensión con 1 ml de Trizol para disociar los tejidos tumorales con un homogeneizador (PRO200, FLUKO, China) durante 2 min y luego se colocaron en hielo durante 15 min para permitir la lisis celular. Posteriormente, los sobrenadantes se obtuvieron por centrifugación a 4 °C, 6000 × g durante 15 min. Luego, se mezclaron 0,5 mL del sobrenadante con cloroformo (0,2 mL) y se osciló durante 2 min para extraer el ácido nucleico. Después de guisar durante 5 min en hielo, la mezcla se centrifugó a 4 °C 6000 × g durante 15 min. La solución acuosa superior (0,2 ml) se recogió y se transfirió a un tubo Eppendorf nuevo libre de ARNasa. Se añadió isopropanol (0,2 ml) a los sobrenadantes y se centrifugó a 4 °C, 6000 × g durante 15 min. Los sedimentos se recogieron y lavaron con etanol al 75%. El ARN resultante se volvió a disolver en 20 μl de agua con pirocarbonato de dietilo (DEPC) para cuantificar la concentración con el espectrofotómetro Nanodrop 2000c (Thermo Fisher, EE. UU.) a una DO de 260 nm. El análisis de PCR se realizó en Anhui Leaobei Biotechnology Co. LTD (Tongling, China) con un kit de ensayo SYBR Green (Thermo Fisher, EE. UU.) bajo un sistema de PCR en tiempo real (ABI-7300, EE. UU.). Los datos se analizaron con el software ABI Prism 7300 SDS y los niveles de ARNm de cada gen en dos grupos (n = 3) se normalizaron a los de GAPDH. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla complementaria 2.

Ratones BALB/c sanos (edad: 6–8 semanas; peso: 20 g) se distribuyeron aleatoriamente en tres grupos lanzando dados. Los animales fueron anestesiados para la administración de suspensiones de PMC (25 μL, 3,6 × 104/mL) o un volumen igual de PBS el día 0 mediante inyección intraperitoneal o subcutánea. Radiaciones NIR a 300 mW/cm2 fueron expuestas a animales cada día. El comportamiento y la apariencia de los animales se inspeccionaron periódicamente después de la inyección. Los ratones tratados se sacrificaron por inhalación de CO2 en los días 1, 3 y 8 para recolectar órganos (corazón, hígado, pulmón, riñón, cerebro, bazo y piel) y sangre. Los tejidos de los órganos se fijaron para la tinción con H&E o TUNEL. Las muestras de sangre (~400 μL cada ratón) se sometieron a la detección de indicadores sanguíneos de rutina mediante el analizador de hematología Mindray BC-2800Vet (Mindray Global, China).

Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces con tres a diez repeticiones. Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (DE) de al menos tres repeticiones. Todas las imágenes confocales y las imágenes de tinción inmunohistoquímica se repitieron al menos tres réplicas. El análisis de datos se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas o la prueba de rango logarítmico a través del software estadístico SPSS 17.0. La diferencia se consideró estadísticamente significativa si p < 0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de origen se proporcionan con este documento. Los datos restantes están disponibles en el archivo de artículos, información complementaria o datos de origen. Los datos de imágenes se depositan en un depósito público, Zenodo Dataverse, siguiendo https://doi.org/10.5281/zenodo.6588765 Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (21976126 a RL), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (BK20211545 a RL), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2020YFA0710700 a RL).

Estos autores contribuyeron igualmente: Weili Wang, Huizhen Zheng.

Laboratorio Estatal Clave de Medicina y Protección Radiológica, Escuela de Ciencias Radiológicas e Interdisciplinarias (RAD-X), Centro de Innovación Colaborativa de Medicina Radiológica de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu, Facultad de Medicina de Suzhou, Universidad de Soochow, Suzhou, Jiangsu, 215123, China

Weili Wang, Huizhen Zheng, Jun Jiang, Hui Wang, Jie Jiang, Qianqian Xie, Meng Gao y Ruibin Li

Departamento de Radiología Intervencionista, Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Soochow, Universidad de Soochow, Suzhou, Jiangsu, 215001, China

zhi li

Instituto de Trasplante de Sangre y Médula, Centro Nacional de Investigación Clínica de Enfermedades Hematológicas, Universidad de Soochow, Suzhou, China

Dongpeng Jiang, Xiangru Shi y Jianhong Chu

Escuela de Salud Pública, Facultad de Medicina de Suzhou, Universidad de Soochow, Suzhou, Jiangsu, 215123, China

Xiaoming Cai

División de NanoMedicina, Departamento de Medicina, Instituto de Nanosistemas de California, Universidad de California, Los Ángeles, CA, 90095, EE. UU.

tian xia

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RL concibió la idea y diseñó los experimentos. WW realizó la mayoría de los experimentos. HZ y Ju.J. construyó los PMC. HZ realizó pruebas de proliferación celular, HIF-1α, qPCR, nuevas imágenes de células hijas y producción de adenosina. ZL realizó experimentos de implantación de tumores de conejo. Ju.J. realizaron experimentos de implantación de tumores en ratones. DJ, XS y JC contribuyeron en la extracción de células T y NK, así como en la prueba de actividad. HW y Ji.J. nivel de oxígeno probado en el tumor. XC, QX cuantificaron el nivel de HIF-1α en células y tumores. MG contribuyó en la prueba de viabilidad celular. TX aportó la idea de la inmunoterapia en el microambiente de la hiperoxia. La redacción del manuscrito estuvo a cargo de RL con la participación de WW

Correspondencia a Ruibin Li.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Wang, W., Zheng, H., Jiang, J. et al. Ingeniería de microfábricas de oxígeno para retardar la progresión tumoral a través de microambientes hiperóxicos. Nat Comun 13, 4495 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32066-w

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Recibido: 22 de marzo de 2022

Aceptado: 18 julio 2022

Publicado: 02 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32066-w

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