Destino molecular

Nature, volumen 615, páginas 482–489 (2023)Citar este artículo

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La eficacia protectora de los anticuerpos séricos resulta de la interacción de clones de células B específicas de antígeno de diferentes afinidades y especificidades. Estas dinámicas celulares subyacen a fenómenos a nivel sérico como el pecado antigénico original (OAS), una propensión propuesta del sistema inmunitario a depender repetidamente de la primera cohorte de células B involucradas en un estímulo antigénico cuando se encuentran con antígenos relacionados, en detrimento de la inducción de respuestas de novo1,2,3,4,5. La supresión de tipo OAS de nuevos anticuerpos específicos de variante puede representar una barrera para la vacunación contra virus de rápida evolución como la influenza y el SARS-CoV-26,7. La medición precisa de la supresión de tipo OAS es un desafío porque los orígenes celulares y temporales no se pueden atribuir fácilmente a los anticuerpos en circulación; por lo tanto, su efecto sobre las respuestas de anticuerpos subsiguientes sigue sin estar claro5,8. Aquí presentamos un enfoque de mapeo de destino molecular con el que los anticuerpos séricos derivados de cohortes específicas de células B pueden detectarse diferencialmente. Mostramos que las respuestas séricas al refuerzo homólogo secuencial se derivan abrumadoramente de las células B de la cohorte primaria, mientras que la inducción posterior de nuevas respuestas de anticuerpos de las células B ingenuas se suprime fuertemente. Tal "adicción primaria" disminuye drásticamente en función de la distancia antigénica, lo que permite la reinmunización con glicoproteínas virales divergentes para producir respuestas de anticuerpos de novo dirigidas a epítopos que están ausentes en la variante de sensibilización. Nuestros hallazgos tienen implicaciones para la comprensión de la OEA y para el diseño y prueba de vacunas contra patógenos en evolución.

La capacidad de los anticuerpos séricos para proteger contra la infección es una propiedad emergente de la mezcla compleja de inmunoglobulinas secretadas con el tiempo por clones de células B de diversas especificidades y de una variedad de afinidades. Las células plasmáticas que producen estos anticuerpos surgen a través de múltiples vías paralelas, que van desde la diferenciación directa de precursores de células B vírgenes después de la infección primaria o la inmunización hasta rutas elaboradas que implican una o más rondas de maduración por afinidad en centros germinales (GC) y fases intercaladas de células B de memoria. . La complejidad de estas vías celulares se combina notablemente con la exposición antigénica repetida9,10,11,12, y su contribución final al conjunto de anticuerpos séricos ha sido difícil de descifrar. Por un lado, los análisis moleculares de genes de inmunoglobulinas obtenidos de células B de memoria o GC no evalúan directamente la composición de anticuerpos en el suero13,14,15,16; por otro lado, los estudios directos de la composición clonal del anticuerpo sérico no pueden asignar fácilmente un origen celular o temporal a anticuerpos de diferentes especificidades17,18. Por lo tanto, la dinámica clonal de los fenómenos inmunitarios que tienen lugar a nivel sérico sigue sin comprenderse bien.

Un fenómeno de nivel sérico que ha sido particularmente difícil de desentrañar es la OEA, descrita en la década de 1950 como una tendencia de las personas expuestas a una determinada cepa de influenza a responder con anticuerpos que reaccionan con mayor fuerza a la primera cepa de influenza que encontraron a principios de la década de 1950. infancia que a la propia cepa de exposición1,19. OAS se atribuyó originalmente a una propensión del sistema inmunitario a reutilizar repetidamente la primera cohorte de células B que responden a un antígeno, cuya reactividad estará necesariamente sesgada hacia la cepa que la provocó originalmente. Sin embargo, en contraste con conceptos relacionados como antigüedad antigénica4,20, OAS (como se define aquí) requiere la supresión activa del reclutamiento de novo de nuevos clones de células B del repertorio ingenuo después del refuerzo2,3,4, restringiendo así la capacidad del sistema inmunitario para montar respuestas de anticuerpos específicos para escapar de los epítopos. La medida en que esta supresión activa existe e influye en las respuestas posteriores se ha debatido durante décadas5,8. Más recientemente, los experimentos de mapeo del destino de las células B en ratones han demostrado que, en aparente contraste con las predicciones de OAS, los GC que se forman en respuesta al refuerzo consisten casi exclusivamente en células B ingenuas en lugar de células B derivadas de la memoria21,22,23. Esta adición posterior implica que los efectos de la OAS en ratones son insignificantes o que la OAS es un fenómeno que se observa exclusivamente a nivel sérico.

Resolver este problema, además de comprender en general el efecto de la OAS en la respuesta a la exposición repetida al antígeno, requeriría la capacidad de transponer dichos experimentos de mapeo del destino celular al propio anticuerpo sérico. Para lograr esto, adaptamos la estrategia clásica de mapeo del destino para permitir la detección del origen celular y temporal de los anticuerpos en el suero, un enfoque que llamamos mapeo del destino molecular. Diseñamos ratones en los que el extremo C del gen de la cadena ligera (Igk) de la inmunoglobulina kappa (Igκ) se extiende para codificar una etiqueta Flag flanqueada por LoxP, seguida de una etiqueta Strep corriente abajo (Fig. 1a y Extended Data Fig. 1). Las células B que portan este alelo 'Κ-tag' producen inmunoglobulinas marcadas con Flag a menos que estén expuestas a la recombinasa Cre, después de lo cual cambian permanentemente la etiqueta Flag por una etiqueta Strep. Por lo tanto, la recombinación mediada por Cre mapea el destino de los anticuerpos que estas células B y sus descendientes de células plasmáticas expresan en sus superficies y/o secretan en el suero. Esto permite la detección diferencial de anticuerpos Igκ+ antes y después del mapeo del destino utilizando reactivos secundarios específicos para cada etiqueta.

a, Esquema del alelo IgkTag (K-tag) antes y después de la recombinación mediada por Cre. UTR, región no traducida. b, Análisis de citometría de flujo de células B sanguíneas que muestra la expresión de receptores de células B marcados con Flag y Strep en ratones del genotipo indicado. c, análisis de transferencia Western de suero obtenido de ratones del genotipo indicado, teñido para cadenas ligeras de Igκ o etiquetas Flag/Strep. Representante de dos experimentos. d, Esquema de la estrategia de inmunización utilizada para mapear el destino de las células B GC y su producción de anticuerpos. e, Análisis de citometría de flujo del ganglio linfático poplíteo 12 días después de la inmunización de la almohadilla plantar con TNP-KLH en adyuvante de alumbre. Los linfocitos B (B220+CD4-CD8-CD138-) se tiñeron para marcadores de GC (Fas+CD38-) y de linfocitos B foliculares (Fo) (Fas-CD38+). f, Cuantificación de los datos en e. Cada punto representa un ganglio linfático individual y las barras representan los valores medios. g, IgG total anti-TNP y títulos de punto final específicos de etiqueta determinados por ELISA de TNP4-BSA en ratones inmunizados ip con TNP-KLH en adyuvante de hidrogel. Las líneas finas representan ratones individuales y las líneas gruesas vinculan las medianas de los valores de título transformados logarítmicamente en cada momento. Los resultados son de nueve ratones de dos experimentos independientes. Tmx., tamoxifeno. h, la afinidad relativa de los anticuerpos anti-TNP Flag+ y Strep+ de las mismas muestras mostradas en g según lo estimado por ELISA usando TNP1-BSA o TNP13-BSA como reactivos de captura. Los datos son la media ± sem de los valores de título transformados logarítmicamente. La relación entre los títulos de anti-TNP1-BSA y anti-TNP13-BSA se calculó por muestra, como se muestra a la derecha.

Para verificar la funcionalidad del alelo Κ-tag, primero determinamos que las células B en ratones IgkTag expresaban receptores de células B etiquetados en su superficie. Siguiendo las reglas de exclusión alélica24, alrededor del 50 % y el 95 % de las células B de ratones que expresaban Igk heterocigotos (tipo salvaje (WT)/tag) u homocigotos IgkTag/Tag eran Flag+ (como se esperaba, alrededor del 5 % de las células B en ratones homocigotos los ratones portaban una cadena ligera de Igλ24; Datos extendidos Fig. 2a). Ratones con etiqueta Κ en los que todas las células B expresaron constitutivamente la recombinasa Cre (IgkTag/TagCd79aCre/+) reemplazaron Flag con una etiqueta Strep en casi todas las células B Igκ+ (Fig. 1b). Es importante destacar que los ratones con etiqueta Κ secretaron apropiadamente anticuerpos etiquetados con Flag o Strep en el suero en ausencia o presencia de Cre recombinasa, respectivamente (Fig. 1c), sin afectar los niveles de anticuerpos séricos en estado estacionario (Datos extendidos Fig. 2b). La generación y maduración de las células B etiquetadas con Κ no se vio afectada, como lo indica la proporción igual de células B circulantes etiquetadas y no etiquetadas en ratones IgkWT/Tag (Fig. 1b). Lo mismo ocurría con las células B circulantes y las células plasmáticas de la médula ósea que expresaban etiquetas Flag y Strep en IgkFlag/Strepmice, en las que uno de los dos alelos etiqueta Κ estaba prerecombinado por la expresión de Cre en la línea germinal (Fig. 1b y Datos extendidos Fig. 2c).

Para garantizar que las células B Flag+ y Strep+ fueran igualmente competitivas durante el curso de la activación de las células B, la maduración de la afinidad y la diferenciación de las células plasmáticas, preparamos y potenciamos ratones IgkFlag/Strep con el antígeno modelo 2,4,6-trinitrofenil-hemocianina de lapa ojo de cerradura ( TNP-KLH) en adyuvante de alumbre y siguió los títulos séricos de anticuerpos que portaban cada etiqueta a lo largo del tiempo. Para permitir una comparación directa de los títulos de anticuerpos anti-TNP que llevan cada etiqueta, diluimos anticuerpos secundarios (anti-Flag o anti-Strep) para lograr una detección similar de las curvas estándar generadas usando anticuerpos monoclonales recombinantes etiquetados con Flag o Strep (datos extendidos). Figura 2d). Los títulos de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de punto final normalizados usando estas curvas mostraron un rango similar de reactividad anti-TNP entre las fracciones Flag+ y Strep+ (Datos extendidos Fig. 2e), indicativo de igual competitividad de las células B marcadas de manera diferente.

El seguimiento del anticuerpo sérico producido por las células B involucradas en diferentes etapas de la respuesta inmune requiere un mapeo del destino restringido temporalmente de los clones de células B activados. Para permitir esto, cruzamos ratones IgkTag con el alelo 25 transgénico S1pr2-creERT2 BAC inducible por tamoxifeno específico de GC (para generar ratones S1pr2-IgkTag). El tratamiento de ratones con tamoxifeno los días 4 y 8 después de la inmunización con TNP-KLH condujo a una recombinación eficiente (96,1 ± 0,50 % (media ± sem) ((Strep+/Tag+) × 100)) del alelo Κ-tag en las células B GC pero no en células B no GC en el mismo ganglio linfático a los 12 días después de la inmunización (dpi) (Fig. 1d-f). Nuevamente, las células B etiquetadas se encontraron en proporciones similares a las células B no etiquetadas en ratones heterocigotos S1pr2-IgkWT/Tag (en promedio 41 ± 9,0 % (media ± sd) Tag+), lo que indica que la expresión de la etiqueta no afecta la competitividad de las células B en el GC (Datos extendidos Fig. 2f, g). Las células B GC en animales Cre– (Fig. 1f) o ratones S1pr2-IgkWT/Tag no tratados con tamoxifeno permanecieron Flag+, con solo una mínima recombinación espontánea (1.3 ± 1.0% (media ± sd) Strep+ en el día 12 dpi) en el último (Datos ampliados Fig. 2g).

Los anticuerpos IgG anti-TNP totales en ratones S1pr2-IgkTag inmunizados por vía intraperitoneal (ip) con TNP-KLH en alhidrogel y tratados con tamoxifeno los días 4, 8 y 12 se detectaron por primera vez en el suero a los 8 dpi y aumentaron progresivamente hasta los 60 dpi (Fig. .1g). La desconvolución de anticuerpos derivados de GC (Strep+) y no derivados de GC (Flag+) mostró que una ola inicial de anticuerpos extrafoliculares Flag+ que alcanzó su punto máximo a los 8 ppp fue reemplazada progresivamente por anticuerpos Strep+ derivados de GC que se detectaron por primera vez en el suero a los 14 ppp (Figura 1g). Los anticuerpos anti-TNP Flag+ retrocedieron a niveles cercanos a la línea de base entre 47 y 60 ppp, como se esperaba de su origen extrafolicular. Un ELISA anti-TNP dependiente de afinidad mostró una maduración de afinidad detectable solo en la fracción de anticuerpo Strep+ derivado de GC (Fig. 1h), lo que confirma el mapeo de destino eficiente del anticuerpo derivado de GC. La señal de fondo en los animales de control a los que no se les administró tamoxifeno permaneció por debajo del límite de detección (LOD) durante toda la respuesta primaria (Datos extendidos Fig. 2h). Por lo tanto, el modelo de ratón S1pr2-IgkTag nos permite discernir anticuerpos derivados de la primera ola de células B que entraron en una reacción de GC en respuesta a la inmunización. Nuestros datos también muestran que las respuestas extrafoliculares tienen una duración relativamente corta en estos entornos y que casi todos los anticuerpos detectables después de las primeras semanas de inmunización, y especialmente los anticuerpos con alta afinidad, se derivaron de células plasmáticas de origen GC.

Con este sistema en la mano, buscamos medir la medida en que la supresión de tipo OAS afecta el desarrollo de respuestas de anticuerpos de novo al refuerzo homólogo (nos referimos a esta supresión genéricamente como adicción primaria, para abarcar el régimen homólogo). Con este fin, aprovechamos la capacidad de desencadenar la recombinación mediada por Cre del alelo Κ-tag de una manera resuelta en el tiempo mediante la administración de tamoxifeno para marcar los anticuerpos séricos producidos por las células B que formaron GC en respuesta a la inmunización primaria (el cohorte primaria). Además de marcar las células B de la cohorte primaria, este enfoque también 'mapa de destino inverso' con una etiqueta Flag cualquier anticuerpo que surja de clones comprometidos de novo por dosis de refuerzo posteriores. Esta propiedad nos permite distinguir entre dos modelos de respuesta de anticuerpos de recuerdo: (1) un modelo de contribución secuencial simple, en el que las respuestas de novo, aunque más pequeñas que las derivadas de la memoria, pueden progresar con una cinética similar a una nueva respuesta primaria. , sumándose a medida que se aportan más dosis de antígeno (relacionado con la antigüedad antigénica); y (2) un modelo de adicción primaria (relacionado con OAS), en el que la respuesta primaria suprime activamente la aparición de respuestas de anticuerpos de novo posteriores incluso después de varios refuerzos (Fig. 2a).

a, Esquema de la contribución secuencial y los modelos de adicción primaria de la impronta antigénica. b, La estrategia de inmunización general utilizada para medir la adicción primaria. Se inmunizaron ratones S1pr2-IgkTag/Tag en los días indicados por flechas negras con TNP-KLH en alumbre (c, d) o WH1 mRNA-LNP (e-g) y se trataron con tamoxifeno a los 4, 8 y 12 ppp como se indica por las flechas rojas. c, IgG sérica anti-TNP (izquierda), Igκ (centro) y títulos específicos de etiqueta (derecha) medidos usando TNP4-BSA por ELISA. Los resultados son de cuatro ratones de dos experimentos independientes. Las líneas finas representan ratones individuales y las líneas gruesas vinculan las medianas de los valores de título transformados logarítmicamente en cada punto de tiempo. d, el porcentaje del título de TNP derivado de la cohorte primaria de células B (el índice de adicción primario) se calculó dividiendo el título de Strep+ de cada muestra individual por su título total (Strep+ + Flag+), multiplicado por 100 (S/( S + F) × 100). e, Anti-WH1 RBD IgG (izquierda), Igκ (centro) y títulos específicos de etiqueta (derecha) medidos por ELISA. Los resultados son de 12 ratones de 3 experimentos independientes. f, El índice de adicción primaria se calculó como se describe en d. g, Comparación de las respuestas de anticuerpos Flag+ de novo en presencia o ausencia de inmunización primaria. WWW, tres dosis de ARNm de WH1 S; ØWW, se omiten la primera dosis y el mapeo del destino. Los datos de WWW son para las mismas muestras que en e, medidos nuevamente en el mismo ensayo que ØWW. h, la respuesta cuaternaria anti-WH1 RBD (izquierda) y el índice de adicción primaria (derecha) en ratones que recibieron una cuarta dosis de mRNA-LNP 133 días después de la dosis anterior, para una de las cohortes que se muestran en e. Dos de los cinco ratones no fueron muestreados el día 0.

Cebamos ratones S1pr2-IgkTag ip con TNP-KLH adyuvado con alumbre y administramos tamoxifeno a 4, 8 y 12 ppp para mapear el destino de las células B GC de la cohorte primaria y su progenie de células plasmáticas y de memoria (Fig. 2b). En este contexto, todos los anticuerpos derivados de la cohorte primaria son Strep+, mientras que cualquier anticuerpo producido por clones de células B expandidos de novo mediante refuerzo secundario o de mayor orden (incluso por su memoria o progenie de células plasmáticas) se asignará al destino inverso como Flag+. . Es importante destacar que, dado que no confiamos en las diferencias entre las variantes de antígenos para distinguir los anticuerpos primarios de los secundarios o posteriores, este enfoque nos permite medir la adicción primaria a una distancia antigénica cero, es decir, cuando se prepara y se refuerza con exactamente el mismo antígeno. Como es probable que la supresión de las respuestas de anticuerpos de novo disminuya a medida que aumenta la distancia antigénica26,27, este enfoque nos permite estimar la fuerza de la adicción primaria cuando es más fuerte.

El refuerzo homólogo 1 y 2 meses después de la inmunización primaria dio como resultado los aumentos esperados en los títulos de TNP de recuerdo (Fig. 2c) y la formación de GC de recuerdo que estaban dominados por células B derivadas de naive21 (Datos extendidos Fig. 3a). La desconvolución de estas respuestas utilizando ELISA específico de etiqueta reveló que tanto los títulos secundarios como los terciarios estaban fuertemente dominados por anticuerpos mapeados en el destino (Strep+) derivados de células B de la cohorte primaria. Mientras que los anticuerpos Flag+ TNP específicos también aparecieron después de cada refuerzo, sus títulos alcanzaron niveles mucho más bajos y decayeron notablemente con el tiempo (Fig. 2c). Es importante destacar que, en contra de las expectativas del modelo de contribución secuencial (Fig. 2a), los títulos de Flag+ no aumentaron progresivamente entre la segunda y la tercera dosis de antígeno, cuando se habrían reactivado las células B de memoria Flag+. Para sintetizar ambas medidas, creamos un "índice de adicción primaria", calculado dividiendo Strep+ por los títulos totales de Strep+ + Flag+ (S/(S + F) × 100). Esto mostró que casi todos los anticuerpos de recuerdo detectables (media del 95 % y el 97 % de la reactividad sérica a los 14 días después del primer y segundo refuerzo, respectivamente) se derivaron de la cohorte de células B involucrada en la respuesta primaria de GC (Fig. 2d). El agotamiento de IgM de las muestras de suero después del refuerzo dio como resultado una fuerte reducción en los títulos de TNP de recuperación de Flag+ pero no de Strep+, lo que respalda la idea de que las células B de origen ingenuo involucradas en la recuperación generan principalmente una respuesta de células B de tipo extrafolicular (dominada por IgM) (Extended Datos Fig. 3b,c).

Para extender estos hallazgos a un entorno clínicamente relevante, inmunizamos y potenciamos ratones como en la Fig. 2b pero usando una vacuna de ARNm modificada con nucleósidos formulada con nanopartículas lipídicas (LNP) que codifica la forma estabilizada por prefusión (2P) del SARS-CoV- 2 Proteína de pico (S) Wuhan-Hu-1 (WH1), similar a las vacunas de ARNm de SARS-CoV-2 disponibles28. Los anticuerpos secundarios y terciarios del dominio de unión al receptor de la proteína S (RBD) se derivaron nuevamente casi en su totalidad de las células B de la cohorte primaria (Strep +) (Fig. 2e, f). Al igual que con las células B de GC (datos extendidos, figura 2g), se detectó una recombinación espontánea de bajo nivel con anticuerpos Strep+ en respuestas de recuerdo en ratones de control que no recibieron tamoxifeno. Esto dio como resultado una ligera subestimación de los títulos de anticuerpos Flag+ (mediana de 2,1 % y 2,8 % 2 semanas después de la segunda y tercera inmunización, respectivamente; datos ampliados, Fig. 3d). Aunque la adicción primaria fue más pronunciada para el SARS-CoV-2 RBD que para el TNP-KLH después del primer refuerzo (no se detectó ningún anticuerpo nuevo (Flag+) en este momento), 5 de los 12 ratones desarrollaron títulos bajos pero estables de Flag+ anticuerpos anti-RBD después de la tercera dosis. Esta bimodalidad fue independiente de la cohorte experimental y de si el refuerzo se realizó ipsilateral o contralateralmente al sitio de la dosis primaria (Datos ampliados, Fig. 3e) y, por lo tanto, es probable que se atribuya a la variabilidad estocástica inherente a las respuestas de recuerdo altamente oligoclonales21. Para cuantificar el grado en que las respuestas de anticuerpos de novo al refuerzo fueron suprimidas por el cebado previo (es decir, la magnitud del efecto supresor de la adicción primaria), comparamos los anticuerpos Flag+ en ratones que recibieron tres dosis de ARNm-LNP de WH1 (WWW ) a un grupo adicional en el que se omitieron los pasos de cebado y mapeo del destino (ØWW). Las respuestas Flag+ fueron 55 veces menores en ratones WWW en comparación con ratones ØWW a las 4 semanas después de la dosis final (Fig. 2g), lo que indica una fuerte supresión de nuevas respuestas de células B en animales cebados en comparación con lo que habrían sido en ausencia de cebado. Finalmente, la adicción primaria fue duradera, ya que incluso una cuarta inmunización de un subconjunto de ratones (>133 días después del refuerzo anterior) estuvo dominada por anticuerpos marcados con estreptococo (Fig. 2h y Datos extendidos Fig. 3f), nuevamente sin poder demostrar el aumento progresivo en los títulos de anticuerpos Flag+ predicho por un modelo de contribución secuencial simple (Fig. 2a). Llegamos a la conclusión de que la adicción primaria puede ser muy fuerte cuando se mide a una distancia antigénica cero, evidencia de la supresión tipo OAS de las respuestas de células B de novo por inmunidad preexistente.

Para medir cómo responde la adicción primaria a los aumentos en la distancia antigénica entre los antígenos de cebado y refuerzo, utilizamos series históricas de variantes de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza derivadas como modelos. Primero usamos un modelo de infección/inmunización de influenza (Fig. 3a) basado en dos de las cepas para las que se describió originalmente OAS: A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) y A/Fort Monmouth/1/1947 (FM1) 1,19, de los cuales los HA (HAPR8 y HAFM1) comparten un 90 % de identidad a nivel de aminoácidos (Fig. 3b). Al igual que con la inmunización con hapteno y ARNm, la respuesta primaria a HAPR8 se caracterizó por títulos extrafoliculares altos (Flag+) que alcanzaron su punto máximo entre 8 y 16 días después de la infección y luego fueron reemplazados por títulos derivados de GC (Strep+) (Fig. 3c). El refuerzo homólogo con proteína HAPR8 recombinante por vía subcutánea a los 3 y 4 meses después de la infección dio como resultado un aumento de 1 logaritmo en los títulos de unión a Strep+ HAPR8 después del primer refuerzo y un aumento menos pronunciado después del segundo refuerzo. Al igual que con la inmunización con proteínas, la contribución de los anticuerpos no primarios (Flag+) a los títulos totales fue pequeña; aunque aumentó progresivamente entre el primer y el segundo refuerzo, su valor medio máximo fue de alrededor del 10 % de la reactividad HA (Fig. 3c). El refuerzo heterólogo con HAFM1 condujo a un ligero refuerzo inverso de los títulos primarios de Strep+ HAPR8 y casi no tuvo efecto en la reactividad de Flag+ HAPR8 (Fig. 3d), lo que indica una distancia antigénica sustancial entre estas variantes. En consecuencia, los títulos primarios de reactividad cruzada hacia HAFM1 estuvieron completamente ausentes de la respuesta extrafolicular primaria a la infección por PR8 y comenzaron a surgir solo aproximadamente a las 4 semanas en la fracción de anticuerpos Strep+ (Fig. 3d), probablemente como un efecto secundario de la maduración de la afinidad hacia HAPR8. . El refuerzo heterólogo no solo aumentó estos títulos de reactividad cruzada (Strep+) en cerca de 1 log, sino que, lo que es más importante, también indujo respuestas sustanciales de los clones de novo provocados por el refuerzo, ya que alrededor de la mitad de toda la reactividad sérica a HAFM1 se derivó de Flag+. fracción después del segundo impulso (Fig. 3d). La comparación de estos niveles con los alcanzados por dos dosis de HAFM1 en ausencia de una infección previa mostró que la adicción primaria suprimió las nuevas respuestas en 3,8 veces (Datos ampliados, Fig. 4a), mucho menos que la supresión de 55 veces lograda en la vacunación con ARNm homólogo (Figura 2g). Por lo tanto, el refuerzo heterólogo evita en parte la adicción primaria, lo que permite mejorar la expansión y la contribución sérica de los clones de células B específicos de la variante que no están involucrados en la respuesta primaria.

a, Esquema de la infección por influenza y la estrategia de refuerzo de HA. Se infectaron ratones S1pr2-IgkTag/Tag por vía intranasal con influenza PR8 y se reforzaron por vía subcutánea (sc) con HAPR8 o HAFM1 en alhidrogel en los puntos de tiempo indicados. b, Representación de la estructura del trímero de HAPR8 (Banco de datos de proteínas (PDB): 1RU7) con un monómero resaltado en verde azulado y los aminoácidos que divergen entre HAPR8 y HAFM1 en rojo. El porcentaje de identidad de aminoácidos se muestra entre paréntesis. c, títulos de Anti-HAPR8 Flag+ y Strep+ en ratones S1pr2-IgkTag/Tag que recibieron un refuerzo homólogo con HAPR8 (izquierda) y cuantificación de la puntuación del índice de adicción primaria (derecha). d, reactividad ELISA anti-HAPR8 (arriba) y anti-HAFM1 (abajo) en ratones que fueron reforzados heterólogamente con HAFM1. Se muestran los títulos específicos de etiquetas (izquierda) y la cuantificación del índice de adicción primario (derecha). e, La divergencia entre HANC95 y HANC99 o HACA09, coloreada como en b. Modelado sobre la estructura de HACA09 (PDB: 3LZG). f, Títulos específicos de etiqueta anti-HA en ratones cebados con proteína HANY95, que se muestran después del primer refuerzo con HANY95 (homólogo) o con variantes HANC99 o HACA09 (heterólogo), como se describe en Datos extendidos Fig. 4b. Se muestra la reactividad del anticuerpo al antígeno de refuerzo. El curso de tiempo completo y las reactividades contra los tres HA medidos por ELISA para la dilución de suero superior se muestran en Datos extendidos Fig. 4c. g, índice de adicción primaria para el refuerzo de HA, 6 días (izquierda) y 1 mes (derecha) después del segundo refuerzo (tercera dosis). Los valores de p se calcularon usando pruebas t de Student de dos colas, comparando el índice de adicción primaria del homólogo con cada refuerzo heterólogo. Las líneas finas representan ratones individuales y las líneas gruesas vinculan las medianas de los valores de título transformados logarítmicamente en cada momento. Todos los resultados son de dos experimentos independientes, con el número de ratones en cada grupo indicado en los gráficos.

Para verificar esta noción en un rango más amplio de distancias antigénicas, inmunizamos ratones ip con H1 recombinante de la cepa A/Nueva York/614/1995 (HANY95) en adyuvante de alhidrogel, luego potenciamos a estos ratones dos veces, ya sea de manera homóloga con HANY95 o heterólogamente con H1. de cepas A/Nueva Caledonia/20/1999 (HANC99; una cepa ligeramente desplazada con 96 % de identidad de aminoácidos con HANY95) o pandémica A/California/07/2009 (HACA09; una cepa de 'cambio antigénico', con 80 % de aminoácidos identidad, Fig. 3e y datos extendidos Fig. 4b). En general, la adicción primaria fue más débil y más variable en este entorno, incluso con refuerzo homólogo, posiblemente debido a la respuesta primaria débil general provocada por la proteína HAPR8 recombinante (Datos ampliados, Fig. 4c). No obstante, observamos una disminución progresiva de la adicción primaria a medida que aumentaba la distancia antigénica entre los antígenos primario y de refuerzo, de modo que hasta el 80 % de las respuestas séricas totales a HACA09 estaban marcadas con Flag-tagged (lo que corresponde a un 20 % de adicción primaria) después de potenciar con este variante (Fig. 3f,g). La combinación de datos para los experimentos de infección e inmunización de acuerdo con la similitud entre el cebado y el refuerzo de HA mostró una disminución lineal altamente significativa en la adicción primaria a medida que aumentaba la distancia antigénica (Datos extendidos Fig. 4d). Llegamos a la conclusión de que el aumento de la distancia antigénica entre los antígenos de cebado y refuerzo contrarresta la adicción primaria, lo que permite la generación de nuevas respuestas de anticuerpos específicas de variante.

Un entorno en el que la subversión de la adicción primaria por la distancia antigénica es clínicamente importante es la respuesta a las cepas Omicron de SARS-CoV-2 en personas que estuvieron expuestas previamente a antígenos de la cepa WH1. Usamos el sistema K-tag para estimar el grado en que el refuerzo con mRNA-LNP que codifica la proteína S de la cepa Omicron BA.1 fue capaz de superar la adicción primaria generada por el cebado con mRNA-LNP que codifica WH1-S (el WH1 y las cepas BA.1 tienen una identidad de aminoácidos del 98 % y el 92 % en los dominios completos de proteína S y RBD, respectivamente). Preparamos ratones S1pr2-IgkTag con ARNm-LNP de WH1 en la pierna derecha, luego potenciamos estos ratones 1 y 2 meses después con ARNm-LNP de BA.1 o WH1 distalmente en la pierna izquierda (Fig. 4a). El refuerzo indujo respuestas de IgG totales similares a los RBD WH1 y BA.1 en ambos grupos (Fig. 4b). Por el contrario, mientras que los sueros de ambos grupos neutralizaron un pseudovirus WH129 por igual, el suero reforzado con BA.1 fue en promedio 15 veces más potente contra el pseudovirus BA.1, lo que indica una fuerte diferencia cualitativa entre los regímenes de refuerzo heterólogos y homólogos. La deconvolución de estos efectos mediante ELISA específico de la etiqueta reveló respuestas al WH1 RBD que eran indistinguibles entre los animales reforzados de forma homóloga y heteróloga, en el sentido de que los anticuerpos primarios (Strep+) eran fuertemente dominantes en ambos entornos, sin una respuesta significativa de Flag+ después de la respuesta extrafolicular inicial ( Fig. 4c, d). Mientras que se observaron pocos o ningún anticuerpo Strep+ contra BA.1 RBD después de la inmunización primaria, la reactividad de Strep+ de recuerdo contra BA.1 RBD fue igualmente fuerte independientemente de qué variante se usó para el refuerzo (Fig. 4c, d). Esta observación concuerda con informes previos que documentan la evolución de la reactividad cruzada con otras cepas como consecuencia de la maduración de la afinidad hacia la vacunación WH1 en humanos30. Sin embargo, es importante destacar que el refuerzo heterólogo dio como resultado un aumento pronunciado en los títulos de BA.1 RBD generados por clones recién reclutados (Flag +) que no tenían reactividad cruzada con la cepa WH1, una reactividad que de otro modo estaría ausente en los ratones potenciados de manera homóloga (Fig. 4c, d ). En su punto máximo (2 semanas después del segundo refuerzo), los anticuerpos Strep+ representaron un promedio del 73 % (±19 % sd) de la reactividad anti-BA.1 total en ratones reforzados heterólogamente (Fig. 4d). La inducción de nuevos anticuerpos (Flag+) después del refuerzo doble de BA.1 fue aún más pronunciada cuando se analizó la reactividad contra las proteínas WH1 y BA.1 S de longitud completa (Fig. 4e). Dos dosis de BA.1 en ausencia de inmunización previa con WH1 (ØBB) generaron respuestas que fueron solo 3,6 veces más altas que las del grupo WBB (WH1-BA.1-BA.1) (una diferencia que no alcanzó significación estadística; Fig. 4f), mostrando nuevamente que el efecto de la adicción primaria en este entorno se reduce en gran medida en comparación con el observado para el refuerzo homólogo (Fig. 2g). Concluimos que BA.1 es lo suficientemente divergente de WH1 para inducir respuestas de anticuerpos sustanciales de novo, incluso si no es capaz de superar por completo la adicción primaria. Además, la diferencia clave entre el refuerzo homólogo y heterólogo es que solo este último puede provocar una respuesta robusta de novo a la cepa desplazada.

a, Esquema de las estrategias de inmunización. b, títulos de Anti-WH1 (izquierda) y BA.1 RBD IgG (centro) y NT50 del pseudovirus BA.1 (derecha) 2 semanas después de la dosis indicada en S1pr2-IgkTag/Tag inmunizados de forma homóloga (WWW) o heteróloga (WBB) ratones. Los valores de p se calcularon utilizando pruebas t de dos colas. FC, doble cambio. c, Evolución de los títulos específicos de etiqueta anti-WH1 y BA.1 RBD. Las líneas finas representan ratones individuales y las líneas gruesas vinculan las medianas de los valores de títulos transformados logarítmicamente. d, Comparación de los títulos anti-RBD de Flag y Strep que se muestran en c 2 semanas después de la tercera inmunización (izquierda) junto con el índice de adicción primario (derecha). Los valores de p se calcularon utilizando pruebas t de dos colas. e, títulos específicos de etiqueta anti-full-S y el índice de adicción primario para las mismas muestras que en d, 2 semanas después de la tercera dosis. Los resultados en b–d son de dos experimentos independientes; se indica el número de ratones en cada grupo. f, Comparación de las respuestas de anticuerpos Flag+ de novo en ratones WBB frente a ratones en los que se omitieron la primera dosis y el mapeo del destino (ØBB). Los datos de ØBB son para diez ratones de dos experimentos independientes. Los datos de WBB son de c, medidos nuevamente en el mismo ensayo que ØBB. g, Esquema del fraccionamiento de anticuerpos para el ensayo de neutralización. h, títulos BA.1 NT50 para ratones WBB en el mismo momento que en d. Los valores de NT50 posteriores al agotamiento se normalizaron como se describe en Métodos. Los valores de p se calcularon utilizando pruebas t pareadas de una cola. i, La potencia de las fracciones anti-RBD BA.1 Strep+ (sin Flag) y Flag+ (sin Strep). Los valores brutos de NT50 para cada fracción se dividieron por sus respectivos títulos RBD ELISA. Los valores de p se calcularon utilizando pruebas t pareadas de dos colas. j, estructura WH1 RBD (PDB: 6M0J) con cambios de aminoácidos en BA.1 resaltados en rojo. k, Análisis de barrido mutacional profundo de muestras de suero obtenidas de tres ratones WBB 2 semanas después de la tercera inmunización como en d. Los sitios de unión de anticuerpos en RBD están sombreados según la fracción de escape. Se indican las posiciones más dirigidas por cada fracción de suero (los residuos específicos de BA.1 se muestran entre paréntesis).

Para determinar si la neutralización mejorada de BA.1 observada después del refuerzo heterólogo (Fig. 4b) se debió a la inducción de nuevos anticuerpos específicos de BA.1 en este entorno, fraccionamos muestras de suero WBB tomadas 2 semanas después de la tercera inmunización en Flag preparados agotados (Strep+, primario) y agotados con Strep (Flag+, nuevo) (Fig. 4g y Datos extendidos Fig. 5a) y midieron su potencia neutralizante frente al pseudovirus WH1 y BA.1. Como era de esperar, el agotamiento de los anticuerpos Flag+ tuvo un efecto mínimo en la neutralización de WH1, mientras que el agotamiento de Strep+ resultó en una disminución mucho mayor (1,7 veces frente a 8,5 veces, respectivamente; Datos ampliados, Fig. 5b, c). Por el contrario, la eliminación de anticuerpos nuevos (Flag+) de los sueros WBB dio como resultado una mayor reducción en la neutralización de BA.1 en comparación con la eliminación de anticuerpos primarios (Strep+) (disminución de 4,9 veces frente a 1,9 veces; Fig. 4h), aunque los anticuerpos Strep+ se unieron con más avidez al BA.1 RBD por ELISA (Fig. 4d). Para estimar la potencia neutralizante por unidad de anticuerpo específico, dividimos el título de neutralización al 50% (NT50) derivado del ensayo de pseudovirus BA.1 por el título de unión de punto final obtenido por ELISA específico de BA.1 RBD. Cuando se normalizó a la reactividad de esta manera, el anticuerpo nuevo (Flag+) fue en promedio 7,0 veces más potente para neutralizar BA.1 que el anticuerpo Strep+ producido por los clones de células B de la cohorte primaria en respuesta a WH1 (Fig. 4i). Como se calcula en los datos extendidos, Fig. 5d, alrededor del 80 % del exceso de neutralización de BA.1 por WBB en comparación con las muestras WWW podría atribuirse a la generación de novo de anticuerpos específicos de BA.1 a partir de células ingenuas en lugar de a la maduración por afinidad secundaria o preferencial. selección de células B de memoria de cohorte primaria. Por lo tanto, los anticuerpos que escapan a la adicción primaria después del refuerzo con BA.1 se optimizan para neutralizar la cepa variante.

Finalmente, para obtener información mecanicista sobre cómo la deriva antigénica conduce a la atenuación de la adicción primaria, realizamos un escaneo mutacional profundo31,32 para definir los epítopos WH1 y BA.1 RBD a los que se dirigen los anticuerpos Flag+ y Strep+ en ratones reforzados heterólogamente (Fig. 4j y Extended Datos Fig. 6). Este enfoque nos permitió determinar por separado los epítopos a los que se dirigen el anticuerpo primario y el nuevo en el mismo ratón. Medimos los patrones de escape de anticuerpos de cuatro ratones contra BA.1 (anticuerpos Strep+ y Flag+) y WH1 RBD (solo anticuerpos Strep+), tres de los cuales mostraron picos de dominancia interpretables (Datos extendidos Fig. 7). En estos tres ratones, hubo una clara segregación de los epítopos a los que se dirigen los anticuerpos Strep+ primarios y Flag+ nuevos (Fig. 4k y Datos extendidos Fig. 7). En dos ratones, los anticuerpos Strep+ se dirigieron a los residuos del epítopo 'clase 3' ubicado en la cara exterior del RBD (Arg346, Arg357, Ile468), que, como era de esperar, se conservaron entre WH1 y BA.1 (Fig. 4j, k ). Por el contrario, los anticuerpos Flag+ en ambos ratones se concentraron en el residuo Arg493 específico de BA.1 (Gln493 en WH1), ubicado en la parte superior del RBD en la región de "clase 2" de la superficie de unión a ACE2. El tercer ratón mostró una segregación análoga entre los anticuerpos primarios y nuevos pero dirigidos a diferentes epítopos. Mientras que los anticuerpos Strep+ se centraron en gran medida en el epítopo de clase 1/2 conservado que incluye Gly485/Phe486 (en la parte superior del RBD en la interfaz ACE2), los anticuerpos Flag+ se unieron principalmente a un epítopo que incluye el residuo Lys440 específico de BA.1 ( Asn440 en WH1) en la cara lateral del RBD distal a Gly485/Phe486 (clase 3). En particular, se ha informado que tanto N440K como Q493R conducen a escapar de la neutralización por varios anticuerpos monoclonales33,34,35. Por lo tanto, los tres ratones siguieron una lógica en la que los nuevos anticuerpos provocados por la inmunización heteróloga se dirigían preferentemente a los epítopos que contenían mutaciones de escape específicas de BA.1 y que no se superponían con epítopos unidos por anticuerpos primarios de reacción cruzada. Concluimos que la adicción primaria, al actuar de manera específica para el epítopo, suprime la generación de novo de anticuerpos contra los epítopos conservados, al tiempo que permite la inducción de nuevos anticuerpos dirigidos específicamente a los epítopos desplazados.

En conjunto, sobre la base de nuestros hallazgos utilizando el sistema de etiquetas Κ, destacamos dos puntos principales. En primer lugar, la supresión de las respuestas de anticuerpos de novo por la inmunidad existente, una característica necesaria de la OAS tal como la definimos, es extremadamente potente cuando se mide a una distancia antigénica cero. Estos hallazgos respaldan el modelo de adicción primaria/OAS2 (Fig. 2a) en el que las respuestas existentes evitan la aparición de nuevos anticuerpos séricos contra el mismo antígeno, frente a un modelo de contribución secuencial/antigüedad20 en el que las respuestas de la primera cohorte son más grandes simplemente porque se establecieron primero y por lo tanto impulsado un mayor número de veces. En segundo lugar, la adicción primaria se debilita notablemente a medida que aumenta la distancia antigénica entre las cepas cebadoras y potenciadoras. Esta observación sugiere una explicación de por qué la OEA ha sido tan difícil de documentar experimentalmente de manera consistente5: las mediciones tradicionales, que se basan en las diferencias entre los antígenos desplazados para asignar anticuerpos a las cohortes primarias o de novo, pueden distinguir estas cohortes de manera confiable solo cuando la distancia antigénica es demasiado grande para permitir una detección clara de la adicción primaria. Un ejemplo es que nuestro modelo estima que la adicción primaria entre PR8 y FM1, las cepas del virus de la influenza para las que se describió inicialmente la OAS1,19, es relativamente débil (equivalente a una supresión de 3,8 veces de la respuesta de novo) y puede por lo tanto, ser difícil de determinar sin la precisión que ofrece el modelo K-tag.

Nuestros datos son consistentes con las observaciones en humanos que muestran que, después de la vacunación contra la influenza estacional, una gran proporción de los clonotipos de anticuerpos séricos se retiran de grupos preexistentes, aunque estos estudios permanecieron indiferentes a si los clonotipos de anticuerpos inducidos por la vacuna surgieron de respuestas de novo o de recuperación de células B de memoria no detectadas17,36. Los seres humanos, incluso con su rico historial de exposición al antígeno de la influenza, son capaces de generar respuestas sustanciales de novo en los GC de recuperación, mientras dependen de las células B de memoria para la respuesta inmediata de las células plasmáticas37. Por lo tanto, esperamos que la mecánica general de la adicción primaria que se informa aquí se aplique también a los humanos, al menos en términos generales. En el contexto del SARS-CoV-2, la supresión de tipo OAS puede explicar las pequeñas y variables diferencias en la inducción preferencial de la neutralización de Omicron por vacunas específicas de variante o bivalentes en comparación con la vacunación homóloga38,39,40,41,42. Nuestros datos sugieren que es posible que se requiera una segunda dosis de una vacuna que contenga Omicron para revelar el alcance total de la inducción de anticuerpos de novo mediante el refuerzo con Omicron. Sin embargo, en la práctica, la exposición repetida de la mayoría de las personas a los antígenos WH1 antes de la potenciación con Omicron, así como la posible mayor propensión de los GC humanos a permitir la entrada de células B de memoria reactivadas37, pueden conducir a una supresión más intensa de los anticuerpos específicos de Omicron de tipo OAS. en escenarios de la vida real.

De manera mecánica, nuestras mediciones a distancia antigénica cero indican una división funcional entre los GC de recuerdo y las respuestas séricas en ratones, mientras que los primeros consisten casi exclusivamente en clones de células B derivados de ingenuos21,22,23, los últimos están dominados por los efectos de la adicción primaria. Una posible explicación de esta divergencia es que las células B vírgenes que contribuyen a los GC secundarios no tienen suficiente afinidad para salir del GC como células plasmáticas o para secretar anticuerpos detectables por ELISA directo. La baja unión al antígeno entre las células B GC secundarias derivadas de naive ha sido informada previamente por otros22, lo que es consistente con la última hipótesis. Dado que la deriva antigénica tanto para el virus de la influenza como para el SARS-CoV-2 está impulsada principalmente por el escape inmunológico, la relajación de la OAS en entornos heterólogos debería, en principio, enfocar los clones de células B recién reclutados en epítopos neutralizantes desplazados. Esta opinión está respaldada por los resultados de nuestros experimentos de mapeo de epítopos y neutralización. Además, los anticuerpos de unión a RBD que escaparon de la adicción primaria tendieron a concentrarse en nuevos residuos ubicados dentro de los epítopos que no eran objetivos dominantes de la respuesta de la primera cohorte de reacción cruzada. Este patrón sugiere el enmascaramiento del epítopo mediado por anticuerpos, mediante el cual los anticuerpos séricos que están presentes antes del refuerzo o producidos de forma aguda por las células B de memoria potenciadas compiten con las células B vírgenes para unirse a un epítopo específico, como un mecanismo potencial para la adicción primaria. Efectos similares se han observado previamente mediante la infusión de anticuerpos monoclonales antes de la inducción de una respuesta inmunitaria en ratones y humanos y se prevé que afecten la especificidad fina de las respuestas de recuerdo43,44,45,46. Estos hallazgos no solo indican que la supresión de las respuestas de anticuerpos de novo que ofrece la adicción primaria es específica del epítopo en lugar del antígeno (enmascaramiento del epítopo, en lugar de captura del antígeno47), sino que también sugiere una explicación teleológica de por qué podría ser ventajoso para las células B de memoria. para evitar volver a entrar en GC secundarios21,48, ya que la competencia de las células B de memoria podría inhibir la capacidad de las células ingenuas para generar anticuerpos adaptados a nuevos epítopos en variantes de escape viral. En tal marco, el papel principal de los GC secundarios sería eludir los peores efectos de la OEA.

Los ratones WT C57BL/6J y B6.C(Cg)-Cd79atm1(cre)Reth/EhobJ (Cd79aCre/+, también conocido como Mb1-Cre49) se obtuvieron de The Jackson Laboratory. Los ratones transgénicos S1pr2-creERT2 BAC25 fueron un regalo de T. Kurosaki y T. Okada. Se generaron ratones IgkTag en la Universidad Rockefeller. Diseñamos el alelo como se indica en la Fig. 1a y los datos extendidos de la Fig. 1, con una etiqueta Flag (DYKDDDDK) y una etiqueta Strep-II (WSHPQFEK) separadas por codones de parada y el terminador transcripcional poli-A SV40. La plantilla de ADN monocatenario de 522 nucleótidos (incluidos los brazos de homología 5′ y 3′, cada uno de 100 nucleótidos de largo) y el ARN guía CRISPR (GGAGCTGGTGGTGGCGTCTC) se compraron de IDT y se prepararon de acuerdo con el método de selección de genes Easi-CRISPR50 por el Centro de recursos de selección de genes de la Universidad Rockefeller e inyectados en cigotos obtenidos de ratones C57BL/6 por las instalaciones centrales de Servicios transgénicos de la Universidad Rockefeller. Verificamos que el alelo se insertó correctamente mediante la secuenciación de Sanger en todo el locus utilizando cebadores genómicos ubicados fuera de los brazos de homología. Para disminuir el riesgo de posibles efectos CRISPR fuera del objetivo, se retrocruzó un ratón fundador durante al menos cinco generaciones con ratones C57BL/6J antes de usarlo en experimentos. Para generar ratones IgkFlag/Strep, se cruzaron ratones con escisión de línea germinal (ratones Cre-negativos que muestran tinción de superficie de células B Strep+), obtenidos de recombinación de línea germinal espontánea ocasional en crías Cd79aCre/+IgkTag, con la cepa IgkTag parental. Todos los ratones se mantuvieron en las instalaciones de limpieza de inmunonúcleo de la Universidad Rockefeller en condiciones libres de patógenos específicos. Todos los procedimientos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Rockefeller.

Se indujeron respuestas inmunitarias en ratones (machos y hembras, de 7 a 12 semanas de edad) mediante la inmunización subcutánea de la almohadilla plantar con 10 µg de TNP17-KLH (Biosearch, T-5060) complementada con 1/3 del volumen de alumbre Imject (Thermo Fisher Scientific) o inmunización ip con 50 µg de TNP-KLH preparado con 1/3 del volumen de gel de hidróxido de aluminio o alumbre (alhidrogel, Invivogen); 20 µg de HA estabilizado con trímero producido recombinantemente (ver más abajo) en alhidrogel; inmunización intramuscular de los músculos cuádriceps con 3 µg de ARNm de punta WH1 (ref. 51) o BA.1 encapsulado en nanopartículas lipídicas (ARNm-LNP), generado como se describe a continuación; o por infección intranasal con el virus de la influenza PR8 adaptado a ratones producido en huevos de pollo embrionados (~33 unidades formadoras de placas, proporcionadas por M. Carroll). En ratones S1pr2-IgkTag, la respuesta inmunitaria primaria se mapeó mediante alimentación forzada oral de 200 µl de tamoxifeno (Sigma-Aldrich) disueltos en aceite de maíz a 50 mg ml-1, en los días 4 y 8 para el experimento de citometría de flujo del día 12 ( Fig. 1), los días 4, 8 y 12 para todos los demás experimentos de inmunización, y los días 4, 8, 12 y 16 para el experimento de infección por influenza (Fig. 3). En los experimentos de recuperación de TNP (Fig. 2c), el refuerzo se realizó de manera idéntica a la inmunización primaria, en los puntos de tiempo indicados. Para los experimentos homólogos de mRNA-LNP (Fig. 2e), el refuerzo se realizó de la misma manera que el cebado, excepto que, para algunos ratones, se reforzó el músculo cuádriceps izquierdo (contralateralmente, estratificado en Extended Data Fig. 3e). Para los experimentos de recuperación de ARNm-LNP heterólogos (Fig. 4), el refuerzo fue contralateral en todos los casos. Para los experimentos de inmunización con HA (Fig. 3), el refuerzo con proteína HA homóloga o heteróloga se realizó ipsilateralmente, exactamente como la inmunización primaria. Para los experimentos de infección, los ratones fueron reforzados después de 3 meses mediante inmunización subcutánea de la almohadilla plantar con 5 µg de HAPR8 o HAFM1 preparados con 1/3 de volumen de alhidrogel, como se describió previamente21. En todos los casos, las inmunizaciones de refuerzo adicionales se realizaron de manera idéntica al primer refuerzo. Las muestras de sangre se recogieron mediante punción en la mejilla en microtubos preparados con gel de suero activador de la coagulación (Sarstedt, 41.1378.005).

Los HA recombinantes usados ​​para inmunizaciones y ELISA se produjeron internamente usando el sistema de expresión de proteínas de células CHO, como se describió anteriormente21. Se introdujeron residuos de cisteína en la secuencia de HA para crear enlaces disulfuro estabilizadores de trímeros, como se describió originalmente para H1/A/California/07/2009 (ref. 52). Describimos la producción de HAPR8 y HACA09 previamente21. Para HAFM1 y HANC99, se siguió el mismo procedimiento, incluida la introducción de mutaciones estabilizadoras de trímeros. Para las inmunizaciones, los dominios C-terminales no nativos de HA (foldon, Avi-tag, His-tag) se eliminaron mediante escisión con trombina y los HA se purificaron posteriormente mediante cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC) antes del almacenamiento en solución salina tamponada con fosfato (PBS) . Para ELISA, se usaron proteínas purificadas por FPLC no tratadas con trombina. Se modificó un anticuerpo monoclonal específico de IgY de alta afinidad obtenido de ratones inmunizados con CGG (clon 2.1 (ref. 53)) para su uso como estándar para la detección de ELISA Flag/Strep. Las regiones constantes de cadena pesada y ligera en los plásmidos de anticuerpos monoclonales humanos originales54 se reemplazaron con las regiones constantes de IgG1 e Igκ de ratón y el extremo C de Cκ se modificó para codificar un sitio LoxP y un enlazador Ser-Gly-Gly seguido de un Flag o Strep-tag, produciendo cadenas Cκ que eran idénticas a las producidas por ratones IgkTag antes y después de la recombinación, respectivamente. Los plásmidos de cadena ligera mAb-Flag o mAb-Strep se transfectaron junto con el plásmido de cadena pesada en células HEK293F (Thermo Fisher Scientific, R79007) y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína G como se describió anteriormente53. Las líneas celulares dieron negativo para micoplasma y no fueron autenticadas además de probar la proteína que produjeron. Para comparar la maduración de la afinidad entre los títulos de anticuerpos anti-TNP de Flag+ y Strep+ (Fig. 1h), se realizaron conjugaciones personalizadas de albúmina de suero bovino (BSA) bajas y altas en hapteno. Se incubó BSA (en PBS; Thermo Fisher Scientific, 77110) a 2,5 mg ml−1 con TNP-ε-aminocaproyl-OSu (Biosearch Technologies, T-1030) en PBS con 20 % de dimetilsulfóxido en una relación molar de 1: 2 o 1:20 durante 2 h a temperatura ambiente mientras gira. El TNP-ε-Aminocaproyl-OSu no conjugado se eliminó mediante diálisis en PBS. Las proporciones finales de conjugación TNP:BSA se estimaron en ~1:1 y ~1:13 midiendo la absorbancia a 280 y 348 nm; estos reactivos se conocen como TNP1-BSA y TNP13-BSA. La concentración de BSA se corrigió determinando el coeficiente de extinción para TNP-ε-aminocaproyl-OSu a 280 nm. Excepto en la Fig. 1h, se usó TNP4-BSA comercial (Biosearch Technologies, T-5050) para todos los demás ELISA de TNP (descritos a continuación).

La vacuna de ARNm de WH1 S se diseñó sobre la base de la secuencia de la proteína S del SARS-CoV-2 (Wuhan-Hu-1, GenBank: MN908947.3) donde los aminoácidos de lisina y valina en las posiciones 986–987 se modificaron a residuos de prolina para obtener un inmunógeno codificado por ARNm estabilizado por prefusión. La secuencia de aminoácidos de BA.1 S se obtuvo a partir de WH1 S introduciendo modificaciones específicas de BA.1. Las secuencias de codificación de WH1 y BA.1 S se optimizaron por codones, se sintetizaron y clonaron en un plásmido de producción de ARNm (GenScript) como se describió anteriormente55. La producción de ARNm y la encapsulación de LNP se realizaron como se describió anteriormente55. En resumen, los ARNm se transcribieron para contener colas poli(A) de 101 nucleótidos de longitud. Se usó m1Ψ-5′-trifosfato (TriLink) en lugar de UTP para generar ARNm que contienen nucleósidos modificados. La protección de los ARNm transcritos in vitro se realizó co-transcripcionalmente usando el análogo de trinucleótido cap1, CleanCap (TriLink). El ARNm se purificó mediante purificación de celulosa (Sigma-Aldrich), como se describió anteriormente56. Todos los ARNm se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se almacenaron congelados a -20 °C. Los ARN que contienen m1Ψ purificados con celulosa se encapsularon en LNP mediante un proceso de autoensamblaje como se describió anteriormente, mediante el cual una mezcla de lípidos etanólicos de lípidos catiónicos ionizables, fosfatidilcolina, colesterol y lípidos de polietilenglicol se mezcló rápidamente con una solución acuosa que contenía ARNm a temperatura ácida. pH57. El lípido catiónico ionizable y la composición de LNP se describen en la solicitud de patente WO 2017/004143. Las partículas cargadas con ARN se caracterizaron y posteriormente se almacenaron a -80 °C a una concentración de 1 μg μl-1. El diámetro hidrodinámico medio de estos mRNA-LNP fue de alrededor de 80 nm con un índice de polidispersidad de 0,02 a 0,06 y una eficiencia de encapsulación de aproximadamente el 95 %.

Para el análisis de citometría de flujo de las células B periféricas, se recolectó sangre en microtubos con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para prevenir la coagulación y se trató con tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK) (Lonza) para lisar los glóbulos rojos. Para las muestras de ganglios linfáticos, las suspensiones celulares se obtuvieron mediante disociación mecánica con micropestles desechables (Axygen). Los bazos se homogeneizaron filtrando a través de un filtro de células de 70 µm y se trataron con tampón ACK. Las células de la médula ósea se extrajeron mediante centrifugación de tibias y fémures perforados a hasta 10 000 g durante 10 s y luego se trataron con tampón ACK. Las células de cada tejido se resuspendieron en PBS suplementado con BSA al 0,5 % y EDTA 1 mM y se incubaron primero con FC-block (rat anti-mouse CD16/32, 2.4G2, Bio X Cell) durante 30 min en hielo y luego con varios fluorescentes. anticuerpos marcados (Tabla complementaria 1) durante 30 min. Las células se filtraron y lavaron con el mismo tampón antes del análisis en un citómetro BD FACS Symphony. Los datos se analizaron utilizando FlowJo (v.10).

Para determinar la presencia de anticuerpos etiquetados con epítopo en ratones IgkTag, se analizaron por triplicado muestras de suero de ratones adultos en estado estacionario y estándares de proteína de precisión más dos colores (Bio-Rad) en geles de proteína TGX mini-proteica SDS-PAGE (Bio-Rad). Rad) en condiciones desnaturalizantes, para separar las cadenas de anticuerpos pesadas y ligeras. Las muestras se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno usando el sistema de transferencia de gel Iblot (Invitrogen). Las membranas se bloquearon durante 2 h a temperatura ambiente mientras se agitaban suavemente con leche descremada en polvo al 5 % en PBS-Tween-20 (0,05 %), antes de la incubación durante la noche en el mismo tampón con anti-Flag-HRP 1:2000 (D6W5B, Cell Signaling Technology, 86861S) o anti-Strep (Strep-tag II StrepMAB-Classic, Bio-Rad, MCA2489P) o cabra anti-ratón Igκ-HRP (Southern Biotech, 1050-05). Las membranas se lavaron extensamente con PBS-Tween-20 y posteriormente se incubaron con sustrato ECL de transferencia Western (Amersham) antes de la detección de quimioluminiscencia utilizando el generador de imágenes de gel Azure c300 (Azure Biosystems).

Los ELISA se realizaron como se describió anteriormente21, con modificaciones específicas para permitir la comparación directa Flag/Strep. Los ELISA Flag/Strep se realizaron uno al lado del otro y con estándares internos en cada placa de 96 pocillos. Para detectar los títulos de anticuerpos séricos específicos de antígeno, las placas se cubrieron durante la noche a 4 °C con antígeno en PBS (10 µg ml−1 para TNP4-BSA, 2 µg ml−1 para TNP1/13-BSA conjugado internamente ( véase más arriba), y 1 µg ml−1 para HA y SARS-CoV-2 pico o proteínas RBD (Sinobiological, 40592-V08H, 40592-V08H121, 40589-V08H26; las proteínas WH1 S y RBD fueron un regalo de P. Wilson) ). Para las curvas estándar de Flag/Strep, los pocillos se recubrieron con 10 µg ml−1 de IgY purificada (Gallus Immunotech). Después de lavar con PBS-Tween (PBS + Tween-20 al 0,05 %, Sigma-Aldrich), las placas se bloquearon durante 2 h a temperatura ambiente con BSA al 2,5 % en PBS. Las muestras de suero se diluyeron 1:100 en PBS y se titularon en serie en diluciones triples. Mouse anti-IgY mAb-Flag o mAb-Strep también se titularon en serie en diluciones triples (Datos extendidos Fig. 2d). Las muestras se incubaron durante 2 h y luego se lavaron con PBS-Tween, antes de agregar uno de los siguientes anticuerpos de detección de HRP: cabra anti-ratón IgG (Jackson Immunoresearch, 15-035-071), rata anti-ratón Igκ (Abcam, ab99632), IgM anti-ratón de cabra (Southern Biotech, 1020-05), anti-Flag-HRP de conejo (D6W5B) o anti-Strep de ratón (Strep-tag II StrepMAB-Classic) durante 30–45 min. Las diluciones de los anticuerpos anti-Flag y anti-Strep se definieron de modo que las curvas generadas por la titulación de los anticuerpos monoclonales marcados con Flag y Strep fueran equivalentes (Datos ampliados, Fig. 2d). Después de lavar con PBS-Tween, las muestras se incubaron con sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (forma cinética lenta, Sigma-Aldrich) y la reacción se detuvo con HCl 1 N. La absorbancia de la densidad óptica (OD) se midió a 450 nm en el lector de placas Fisher Scientific accuSkan FC. Para normalizar los títulos de punto final de Flag y Strep, se calculó la dilución del título de suero en la que cada muestra superó el valor umbral de DO de su anticuerpo monoclonal respectivo a una concentración fija de 20 o 6,67 ng µl−1. Los títulos se calcularon por interpolación logarítmica de las diluciones con lecturas inmediatamente por encima y por debajo de la DO del anticuerpo monoclonal utilizado58.

Para los ELISA de IgG en suero total, las placas se recubrieron con IgG anti-ratón. Las curvas estándar se generaron usando IgG de ratón no marcada (Southern Biotech, 0107-01) y la detección se realizó usando IgG-HRP anti-ratón (Southern Biotech). Para eliminar la IgM de las muestras de suero, se usaron perlas de agarosa IgM anti-ratón (Sigma-Aldrich, A4540) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las perlas se lavaron con PBS y las muestras se incubaron en una proporción de 1:20 de muestra a perlas durante la noche a 4 °C con rotación. La fracción de IgM unida a las perlas se eliminó por centrifugación durante 3 min a 10 000 gy la fracción sobrenadante no unida se usó para los ELISA posteriores. Para confirmar la eficiencia del agotamiento de IgM, se midieron los niveles de IgM total como se describe anteriormente para IgG total, con IgM anti-ratón de cabra, IgM sin marcar e IgM-HRP anti-ratón (Southern Biotech).

Los títulos de neutralización del virus se evaluaron en las fracciones de suero Flag+ versus Strep+ de muestras recolectadas de ratones S1pr2-IgkTag inmunizados con S mRNA–LNP. Para separar las fracciones, se realizó inmunoprecipitación con perlas magnéticas anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich, M8823-5ML) y perlas MagStrep tipo 3 XT (IBA, 2-4090-010) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las perlas magnéticas se lavaron con tampón de muestra (solución salina tamponada con Tris para perlas Flag y tampón W 1x (IBA, 2-1003-100) para perlas MagStrep) y las muestras se incubaron en una proporción de 20:1 de muestra. a perlas de resina durante la noche a 4 ° C con rotación. Las fracciones unidas a perlas se separaron utilizando un separador magnético y se desecharon, mientras que la fracción no unida se recogió. Las muestras fraccionadas se concentraron por centrifugación a la mitad de la concentración de entrada y se inactivaron por calor. El grado en que las muestras de suero total y fraccionadas neutralizaron WH1 y BA.1 SARS-CoV-2 se aproximó utilizando el ensayo informador de luciferasa NanoLuc basado en VIH-1 pseudotipado con pico de SARS-CoV-2 descrito anteriormente29. En resumen, las muestras de suero se diluyeron en serie cinco veces con una dilución superior final de 1:00 de suero y se incubaron durante 1 hora a 37 °C con el virus informador VIH-1 pseudotipado en pico SARS-CoV-2 WH1 o BA.1 y luego transferido a células HT1080/ACE2.cl1459. A las 48 h, las células se lavaron y lisaron y se midió la actividad de luciferasa utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Nano-Glo (Promega) y el luminómetro Glomax Navigator (Promega). Las unidades relativas de luminiscencia se normalizaron usando células infectadas en ausencia de suero y luego se representaron gráficamente en GraphPad Prism. Los valores de NT50 se calcularon utilizando una regresión no lineal de cuatro parámetros (método de regresión de mínimos cuadrados sin ponderación) de las curvas que se muestran en Datos extendidos, Fig. 5b. Se muestra la media de dos duplicados técnicos, se excluyeron los puntos atípicos. Para las comparaciones de NT50 entre la entrada y las fracciones (Fig. 4g y datos extendidos, Fig. 5c), la NT50 de las muestras fraccionadas se ajustó para igualar el título BA.1 RBD ELISA de la etiqueta no agotada en comparación con su título ELISA correspondiente en la entrada fracción.

Se diseñaron bibliotecas duplicadas de variantes de saturación del sitio de un solo mutante en el fondo del SARS-CoV-2 Omicron BA.1 spike RBD y producidas por Twist Bioscience, esencialmente lo mismo que se hizo anteriormente para otras variantes de SARS-CoV-260, 61. El mapa GenBank del plásmido que codifica el Omicron BA.1 RBD no mutado en el vector de visualización de levadura está disponible en GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_DMS_Omicron/blob/main/data/3294_pETcon -SARS2-RBD_Omicron-BA1.gb). Twist Bioscience entregó las bibliotecas de variantes de saturación del sitio como fragmentos de ADN de doble cadena y se codificaron con código de barras y se clonaron a granel en la columna vertebral del vector de visualización de levadura. El ADN del plásmido de la biblioteca mutante con código de barras se electroporó en Escherichia coli (células electrocompetentes NEB 10-beta, New England BioLabs, C3020K) y se redujo a alrededor de 1 × 105 CFU (un promedio de> 25 códigos de barras por mutante único). El ADN del plásmido se purificó y transformó en la cepa de levadura AWY101. Los códigos de barras de dieciséis nucleótidos se asociaron con sus variantes BA.1 mediante secuenciación PacBio, y se midieron los efectos de las mutaciones de la expresión de RBD y la unión de ACE2, esencialmente como se describe61. Estos experimentos se describen y analizan en GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_DMS_Omicron).

Los experimentos de mapeo de mutaciones que reducen la unión de RBD de sueros de ratones inmunizados se realizaron por duplicado biológico con bibliotecas de mutantes independientes WH1 o BA.1 RBD, de manera similar a como se describió anteriormente para anticuerpos monoclonales62 y muestras de plasma policlonal humano63. En primer lugar, 75 µl de cada uno de los sueros se depletó dos veces de anticuerpos de unión a levadura no específicos mediante incubación durante 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C con 37,5 unidades OD de levadura AWY101 que contenía un vector vacío, como se describió anteriormente63 . Se indujeron bibliotecas de levaduras RBD mutantes WH1 y BA.161 con medio definido sintético bajo en dextrosa que contiene galactosa con casaminoácidos (SD-CAA, 6,7 g l-1 de base nitrogenada de levadura, 5,0 g l-1 de casaminoácidos, 1,065 g l-1 de MES ácido y galactosa al 2 % (p/v) + dextrosa al 0,1 % (p/v)) para expresar RBD, luego se lava e incuba con suero diluido durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Cada combinación probada de suero de ratón contra cada biblioteca mutante WH1 o BA.1 RBD para la pérdida de unión de anticuerpos Strep o Flag-tag se realizó de forma independiente. Para cada suero, se usó una dilución de subsaturación tal que la cantidad de señal fluorescente debida a la unión del anticuerpo sérico a RBD fuera aproximadamente igual en todas las muestras (1:1000 para el mapeo de anticuerpos Strep contra las bibliotecas WH1; 1:200 para el mapeo de anticuerpos Strep contra las bibliotecas BA.1 y 1:50 para el mapeo de los anticuerpos Flag contra las bibliotecas BA.1). Luego, las bibliotecas de levadura se etiquetaron secundariamente durante 1 hora con anticuerpos anti-MYC conjugados con FITC 1:100 (Immunology Consultants Lab, CYMC-45F) para marcar la expresión de RBD y estreptavidina conjugada con APC 1:200 (Invitrogen S-868) para marcar los anticuerpos Strep unidos o anti-Flag de rata conjugado con APC (BioLegend, 637308) para marcar los anticuerpos marcados con Flag unidos. Se dibujó una puerta de selección de citometría de flujo para capturar mutantes de RBD con unión de anticuerpos reducida para su grado de expresión de RBD. Para cada muestra, se procesaron alrededor de 4 × 106 células en el clasificador de células BD FACSAria II. Las células que escaparon del suero se cultivaron durante la noche en SD-CAA como se definió anteriormente con dextrosa al 2% (p/v), sin galactosa y 100 U ml-1 de penicilina + 100 µg ml-1 de estreptomicina para expandir las células antes de la extracción del plásmido.

El ADN del plásmido se extrajo de 30 unidades OD (1,6 × 108 unidades formadoras de colonias (CFU)) de poblaciones de levadura preseleccionadas y aproximadamente 5 unidades OD (alrededor de 3,2 × 107 CFU) de cultivos nocturnos de células con escape de suero (Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II ) como se describió previamente60,62. Los códigos de barras de 16 nucleótidos que identifican cada variante WH1 o BA.1 RBD se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa y se prepararon para la secuenciación de Illumina como se describió anteriormente60,62. Los códigos de barras se secuenciaron en el sistema Illumina NextSeq 2000 con lecturas de un solo extremo de 50 pb.

Las fracciones de escape se calcularon esencialmente como se describió anteriormente62. Usamos el paquete dms_variants (https://jbloomlab.github.io/dms_variants/, v.1.4.0) para contar cada variante RBD con código de barras en cada preselección y población de escape de suero. Para cada selección, calculamos la fracción de escape para cada variante con código de barras mediante la fórmula proporcionada en la ref. 62. Estas fracciones de escape representan la fracción estimada de células que expresan esa variante específica que cae en el contenedor de escape, de modo que un valor de 0 significa que la variante siempre se une al suero y un valor de 1 significa que siempre escapa a la unión del suero. Luego aplicamos un filtro computacional para eliminar las variantes con > 1 mutación de aminoácido, recuentos de secuenciación bajos (< 50 en la condición de preselección) o mutaciones altamente perjudiciales que podrían causar la fuga de anticuerpos simplemente al conducir a una expresión deficiente de RBD debidamente plegado en la levadura. superficie celular (una puntuación de unión a ACE2 de <-2 o una puntuación de expresión de RBD de <-1,25 o <-0,83361 para las bibliotecas mutantes WH1 y BA.1, respectivamente, lo que refleja los diferentes niveles de expresión de referencia de los dos RBD de tipo salvaje) . Los puntajes de escape de anticuerpos informados a lo largo del documento son el promedio en bibliotecas duplicadas; estos puntajes también se encuentran en la Tabla complementaria 1. Las correlaciones en los puntajes finales de escape de un solo mutante se muestran en Datos extendidos Fig. 6c. La documentación completa del análisis computacional está disponible en GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS).

El logotipo del mapa de escape del suero y los diagramas de líneas se crearon con el paquete dmslogo (https://jbloomlab.github.io/dmslogo, v.0.6.2). La altura de cada letra indica la fracción de escape para esa mutación de aminoácido. Para cada suero, los gráficos del logotipo muestran cualquier sitio en el que para ≥1 condición de etiqueta de biblioteca/anticuerpo, el escape de anticuerpos total del sitio fue >10 veces la mediana en todos los sitios y al menos el 10 % del máximo de cualquier sitio. Para cada muestra, el eje y se escaló para que fuera el mayor de (1) la métrica máxima de escape en el sitio observada para esa muestra o (2) 20 veces la fracción mediana de escape en el sitio observada en todos los sitios para ese plasma. El código que genera estas visualizaciones de gráficos de logotipos está disponible en GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/summary/escape_profiles.md). Para visualizar el escape de suero en la estructura RBD, la superficie WH1 RBD (PDB: 6M0J) se coloreó según la métrica de escape por sitio en cada sitio, donde el blanco indica que no hay escape y el rojo indica el sitio con el mayor escape.

Las pruebas estadísticas utilizadas para comparar las condiciones se indican en las leyendas de las figuras. No se utilizaron métodos estadísticos para determinar el tamaño de la muestra. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando GraphPad Prism v.9. El análisis de citometría de flujo se llevó a cabo utilizando FlowJo (v.10). Los gráficos se trazaron con Prism (v.9) y se editaron para su apariencia con Adobe Illustrator CS. Para los datos representados en escalas logarítmicas (como los títulos de anticuerpos séricos), se realizó un análisis estadístico en los datos transformados logarítmicamente. A las muestras con reactividades por debajo del límite de detección se les asignó un valor de 100, ya que la dilución máxima era 1:100.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las lecturas sin procesar de Illumina de los códigos de barras variantes de 16 nucleótidos de los experimentos de escaneo mutacional profundo están disponibles en NCBI SRA bajo BioProject PRJNA770094, BioSample SAMN30086726. Todos los puntajes de escape se muestran en la Tabla complementaria 1 y están disponibles en GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/supp_data/all_raw_data.csv). Las representaciones de las estructuras Spike RBD y HA se obtuvieron del PDB con los códigos de acceso 6M0J, 1RU7 y 3LZG.

El código completo utilizado para analizar los experimentos de exploración mutacional profunda está disponible en GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS). El código para generar las visualizaciones de gráficos de logotipos está disponible en GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/summary/escape_profiles.md).

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Agradecemos al personal de las instalaciones de Transgenics and Gene Targeting de la Universidad Rockefeller por generar la cepa de ratón K-tag y al Centro de Biociencias Comparativas para el alojamiento de ratones; P. Wilson para el pico recombinante SARS-CoV-2 WH1 y la proteína RBD; JT Jacobsen por la asistencia técnica; ya todo el personal de la Universidad Rockefeller por su continuo apoyo. Este estudio fue financiado por las subvenciones NIH/NIAID R01AI119006 y R01AI139117 a GDV, P01AI165075 a PDB, R01AI146101 y R01AI153064 a NP y R01AI141707 a JDB la Fundación Robertson. AS recibió el apoyo de una beca de doctorado de Boehringer-Ingelheim Fonds. PDB y JDB son investigadores del HHMI. GDV es un investigador de Burroughs-Wellcome en la patogenia de las enfermedades infecciosas, un becario Pew-Stewart y un becario MacArthur.

Laboratorio de dinámica de linfocitos, Universidad Rockefeller, Nueva York, NY, EE. UU.

Ariën Schiepers, Marije FL van 't Wout, Luka Mesin y Gabriel D. Victora

División de Ciencias Básicas y Programa de Biología Computacional, Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson, Seattle, WA, EE. UU.

Allison J. Greaney, Tyler N. Starr y Jesse D. Bloom

Laboratorio de Retrovirología, Universidad Rockefeller, Nueva York, NY, EE. UU.

Trinity Zang y Paul D. Bieniasz

Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina Perelman, Universidad de Pensilvania, Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.

Hiromi Muramatsu y Norbert Pardi

Acuitas Therapeutics, Vancouver, Columbia Británica, Canadá

Paulo JC Lin y Ying K. Tam

Instituto Médico Howard Hughes, Chevy Chase, MD, EE. UU.

Paul D. Bieniasz y Jesse D. Bloom

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AS y MFLv'tW realizaron todo el trabajo experimental, con aportes esenciales de LMAJG, realizaron e interpretaron los experimentos de escaneo mutacional profundo bajo la supervisión de TNS y JDBNP y HM diseñó y produjo ARNm codificadores de WH1 y BA.1 S. PJCL y YKT formularon ARNm en LNP. TZ llevó a cabo ensayos de neutralización de pseudovirus bajo la supervisión de PDBAS y GDV diseñó el alelo K-tag y todos los experimentos del estudio y escribió el manuscrito con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Gabriel D. Victora.

NP se nombra en una patente (62/153,143 — ARN modificado con nucleósidos que induce una respuesta inmunitaria adaptativa), que describe el uso de ARNm modificado con nucleósidos en LNP como plataforma de vacunas. Ha revelado esos intereses completamente a la Universidad de Pensilvania y tiene un plan aprobado para manejar cualquier conflicto potencial que surja de la licencia de esa patente. PJCL y YKT son empleados de Acuitas Therapeutics, una empresa que participa en el desarrollo de terapias de ARNm-LNP. YKT se menciona en una patente (WO 2017/004143: Formulaciones de lípidos y nanopartículas lipídicas para la administración de ácidos nucleicos) que describe los LNP para la administración de tratamientos con ácidos nucleicos, incluido el ARNm, y el uso de ARNm modificado en nanopartículas lipídicas como plataforma de vacunas. . PDB ha realizado trabajos de consultoría en el área de vacunas COVID para Pfizer. JDB consulta o ha consultado recientemente para Apriori Bio, Oncorus, Merck y Moderna en temas relacionados con virus, vacunas y evolución viral. JDB, TNS y AJG figuran como inventores en las patentes con licencia de Fred Hutch (62/935,954 y 62/692,398) relacionadas con la exploración de mutaciones profundas virales. GDV y JDB son asesores de la Empresa de Vacunas.

Nature agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Secuencia de nucleótidos de la plantilla de ADN de 522 pb utilizada para generar el alelo IgkTag, con traducciones de aminoácidos proporcionadas para todas las secuencias de codificación (fuente en negrita). Los números de nucleótidos se dan para cada línea. La traducción de aminoácidos se coloca debajo del nucleótido central de cada codón.

(a) Gráficas de citometría de flujo representativas de células B periféricas (bloqueadas: B220+CD4–CD8–CD138–) obtenidas de la sangre de ratones WT e IgkTag/Tag, teñidas para la expresión superficial de inmunoglobulinas etiquetadas con FLAG e Igλ. (b) Concentración total de IgG en el suero de WT, IgkTag/Tag y Cd79aCre/+. Ratones IgkTag/Tag según lo determinado por ELISA. Las diferencias no fueron significativas por ANOVA de una vía (p < 0,05). ( c ) Citometría de flujo de células plasmáticas (PC) de médula ósea en estado estacionario obtenidas de ratones IgkFLAG / Strep adultos (6 semanas de edad). La estrategia de activación para PC se muestra en el panel izquierdo (preajustada en células T no CD4/CD8), para PC IgA+ e Igλ– de superficie en el panel central y para FLAG/Strep en el panel derecho. La cuantificación en 9 ratones de 3 experimentos independientes se muestra en el panel más a la derecha (cada punto representa un ratón individual IgkFLAG/Strep, la línea representa la mediana). (d) Curvas estándar de ELISA con anticuerpo monoclonal (mAb)-FLAG y mAb-Strep detectados en diluciones de los respectivos anticuerpos HRP donde las curvas se superponen. La concentración de mAb a la que las curvas cruzaron el umbral de fondo de absorbancia (indicado por las líneas de puntos) se utilizó para calcular el título de punto final, como se describe en la sección de métodos. (e) Títulos anti-TNP específicos de etiqueta en ratones IgkFLAG/Strep inmunizados y reforzados ip con TNP-KLH/alumbre en los puntos de tiempo indicados por flechas negras. Los resultados son de 14 ratones de 2 experimentos independientes. El punto de tiempo del día 7 no se recopiló para la primera cohorte. Las líneas finas representan ratones individuales, las líneas gruesas vinculan las medianas de los valores de título transformados logarítmicamente en cada punto de tiempo. ( f ) Citometría de flujo de ratones S1pr2-IgkWT / Tag como en la Fig. 1d, e. con cuantificación en (g), se incluyen grupos control cre– y sin tamoxifeno. Los puntos de datos son de 6 a 13 ganglios linfáticos poplíteos por grupo de al menos 2 experimentos independientes. ( h ) Reactividad ELISA anti-TNP para ratones S1pr2-IgkTag/Tag inmunizados como en la Fig. 1d. Se obtuvo suero a 47 dpi de 6 ratones que recibieron tamoxifeno y 4 que no recibieron tamoxifeno. Se muestra la absorbancia ELISA de IgG (izquierda), FLAG (centro) y Strep (derecha). Las muestras se diluyeron 1:100.

( a ) Citometría de flujo de GC secundarios en el bazo de 3 ratones S1pr2-IgkTag / Tag cebados y reforzados con 3 TNP-KLH ip, con marcaje con tamoxifeno a 4, 8 y 12 ppp. Activado en células B de GC (FAS+CD38–B220+CD4–CD8–CD138–) que expresan FLAG o Strep-tag como en la Fig. 1e. (b) Concentraciones totales de IgM de muestras de suero antes y después de la eliminación de IgM mediante inmunoprecipitación, medidas por ELISA. Los datos son de 8 muestras de suero, de los mismos 4 ratones que en la Fig. 2c. ( c ) Títulos anti-TNP específicos de etiqueta antes y después del agotamiento de IgM para muestras recolectadas 6 días después del primer y segundo refuerzo con TNP-KLH (las mismas muestras que en (b) y Fig. 2c). Las barras representan las medias de los títulos logarítmicos transformados y las barras de error son SEM. Los valores P son para la prueba T pareada de dos colas, solo se muestran los valores estadísticamente significativos (p < 0,05). ( d ) Títulos de fondo Strep + anti-RBD en ratones de control S1pr2-IgkTag / Tag inmunizados como en la Fig. 2b, e, pero no tratados con tamoxifeno. Los gráficos muestran la mediana del porcentaje del título anti-RBD que es Strep+ ((S/(S + F)*100)) en ausencia de tamoxifeno en el punto de tiempo previo al refuerzo y dos semanas después de la segunda y tercera inmunización. Esto representa el porcentaje medio por el cual es probable que los títulos de FLAG+ en las respuestas de recuerdo sean subestimados por la recombinación espontánea del controlador S1pr2-CreERT2. Los datos son de 8 ratones de 2 experimentos independientes. ( e ) Comparación de los datos de adicción primaria que se muestran en la Fig. 2e, f, estratificados por cohorte y refuerzo ipsilateral versus contralateral. La cuarta cohorte de ratones es el grupo reforzado homólogamente que se muestra en la Fig. 4b-e, representado aquí por círculos abiertos. Las barras representan la media de los títulos transformados logarítmicamente, las barras de error son SEM. Los datos son de 16 ratones de 4 cohortes independientes. ( f ) Comparación de la adicción primaria entre las respuestas 3 y 4 en 9 ratones de 2 cohortes, según los datos de la Fig. 2e, f, h. Las barras representan la media de los títulos transformados logarítmicamente, las barras de error son SEM.

( a ) Comparación de las respuestas de anticuerpos FLAG + de novo a HAFM1 en presencia o ausencia de infección primaria con el virus de la influenza PR8. Los datos de PR8>FM1>FM1 son para las mismas muestras que en la Fig. 3d, medidas nuevamente en el mismo ensayo que Ø>FM1>FM1. ( b ) Representación esquemática de la estrategia de impulso principal de HA. Los ratones S1pr2-IgkTag/Tag se cebaron ip con HANY95 en alhidrogel y se potenciaron de forma homóloga o heteróloga con HAN99 o HACA09 en alhidrogel como se indica. ( c ) Curso de tiempo completo de reactividad ELISA específica de etiqueta anti-HA (densidad óptica a una dilución 1: 100) de los mismos ratones que se muestran en la Fig. 3f. Se muestran los ELISA anti-HANY95 (arriba), HANC99 (centro) y HACA09 (abajo), con detección de Strep (izquierda) y FLAG (derecha). ( d ) Relación entre la adicción primaria y la distancia antigénica para experimentos de infección e inmunización. El gráfico recopila los índices de adicción primarios de las figuras 3d y 3g. Las barras están ordenadas por identidad de aminoácidos entre los HA cebadores y potenciadores. Los valores P son para ANOVA unidireccional, con % de identidad como variable categórica, o correlación de Pearson, con (100 – % de identidad) como variable lineal.

(a) Eficiencia del fraccionamiento del suero en fracciones con agotamiento de estreptococos y FLAG, medida mediante ELISA anti-RBD de muestras de entrada frente a muestras posteriores al agotamiento. Se obtuvo suero de ratones inmunizados heterólogamente dos semanas después de la tercera inmunización, Fig. 4d (8 ratones de 2 experimentos independientes). ( b ) Neutralización de WH1 (izquierda) y BA.1 (derecha) SARS-CoV-2 S que expresa el virus VIH-1 pseudotipado por fracciones de suero que se muestran en ( a ). Se muestran los valores medios de los duplicados técnicos. ( c ) títulos de NT50 de pseudovirus WH1 S para muestras en ( b ). Los NT50 posteriores al agotamiento se normalizaron al suero de entrada en función de los títulos BA.1 RBD ELISA (a), aplicando una corrección que igualaba el título anti-RBD Strep de la fracción sin FLAG a la entrada, y el anti-RBD FLAG -título de la fracción empobrecida en Strep a la entrada. Los valores P son para la prueba T pareada de una cola. FC, cambio de pliegue. ( d ) Estimación de la contribución de los anticuerpos de novo frente a los derivados de la memoria a la neutralización excesiva de BA.1 por el régimen WBB. La contribución de la maduración por afinidad secundaria o la selección preferencial de células B de memoria de reactividad cruzada mediante el refuerzo de BA.1, ΔS, se calcula como la diferencia entre los títulos de neutralización de Strep+ WBB y WWW BA.1 totales (se supone que estos últimos son todos FLAG+). La contribución de anticuerpos específicos de BA.1 inducidos de novo por refuerzo de BA.1, F, se proporciona como el título FLAG+ WBB. La contribución porcentual de F a la neutralización mejorada de BA.1 en WBB se calcula como (F/(F + ΔS))*100. Las barras y las líneas punteadas representan las medianas de cada condición, que se utilizaron para calcular F y ΔS. La línea de puntos superior (4.) representa la mediana de la neutralización de los anticuerpos WBB totales y se muestra solo con fines de referencia. Los datos de los grupos 1 y 4 se reproducen de la Fig. 4b, los datos de los grupos 2 y 3 de la Fig. 4h.

( a ) Arriba: Gráficos representativos de la estrategia de activación de FACS anidada utilizada para todos los experimentos para seleccionar células de levadura individuales. Abajo: estrategia de activación para seleccionar células individuales que expresan RBD (FITC-A frente a FSC-A). ( b ) Estrategia de activación de FACS para una de las dos bibliotecas independientes para seleccionar células que expresan mutantes BA.1 o WH1 RBD con unión reducida de anticuerpos Strep o FLAG (células en azul), según lo medido por tinción secundaria con estreptavidina conjugada con APC o conjugada con APC. anticuerpo anti-FLAG, respectivamente. Las puertas se configuraron manualmente para cada muestra para capturar células que tienen una cantidad reducida de unión de anticuerpos etiquetados para su grado de expresión de RBD. Los diagramas de dispersión FACS fueron cualitativamente similares entre las dos bibliotecas. El identificador de ratón (#1-4), la biblioteca de destino de DMS (WH1 o BA.1) y la etiqueta de anticuerpo (Strep o FLAG) se indican encima de cada gráfico. ( c ) Correlaciones de nivel de mutación (izquierda) y sitio (derecha) de puntajes de escape entre dos bibliotecas de réplicas biológicas independientes.

Resultados de escaneo de mutaciones profundas de suero recolectado de 4 ratones inmunizados heterólogamente, 2 semanas después de la tercera dosis (Fig. 4d). Se midió la "fracción de escape" de cada mutación, que varía de 0 (sin efecto de las células sobre la unión de anticuerpos) a 1 (todas las células con la mutación tienen una unión de anticuerpos reducida). El ratón 4 no se muestra en el texto principal ya que no hubo picos interpretables en la unión de anticuerpos a las bibliotecas BA.1 para ninguna de las fracciones de anticuerpos. Los gráficos de logotipos muestran las fracciones de escape de anticuerpos para mutaciones de aminoácidos individuales en sitios clave de escape fuerte. Los sitios en los que BA.1 difiere de la secuencia WH1 se muestran en letra morada. Todos los puntajes de escape se muestran en la Tabla complementaria 1 y están disponibles en línea en https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/supp_data/all_raw_data.csv.

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Schiepers, A., van 't Wout, MFL, Greaney, AJ et al. Mapeo molecular del destino de las respuestas de anticuerpos séricos a la inmunización repetida. Naturaleza 615, 482–489 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05715-3

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Recibido: 29 Agosto 2022

Aceptado: 06 enero 2023

Publicado: 16 enero 2023

Fecha de emisión: 16 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05715-3

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