Estructuras bacterianas rectangulares previamente no caracterizadas en la boca del delfín

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 2098 (2023) Citar este artículo

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Queda mucho por explorar con respecto a la diversidad de microbios no cultivados asociados al huésped. Aquí, describimos estructuras bacterianas rectangulares (RBS) en la boca de los delfines nariz de botella. La tinción de ADN reveló múltiples bandas pareadas dentro de los RBS, lo que sugiere la presencia de células que se dividen a lo largo del eje longitudinal. La microscopía electrónica de transmisión criogénica y la tomografía mostraron segmentos paralelos unidos a la membrana que probablemente son células, encapsuladas por una cubierta superficial periódica similar a una capa S. Los RBS mostraban apéndices inusuales en forma de pilus con haces de hilos extendidos en las puntas. Presentamos múltiples líneas de evidencia, incluida la secuenciación de ADN genómico de RBS micromanipulados, la secuenciación del gen 16S rRNA y la hibridación in situ con fluorescencia, lo que sugiere que los RBS son bacterianos y distintos de los géneros Simonsiella y Conchiformibius (familia Neisseriaceae), con los que comparten una morfología similar. y patrones de división. Nuestros hallazgos resaltan la diversidad de formas y estilos de vida microbianos novedosos que esperan caracterización utilizando herramientas complementarias a la genómica, como la microscopía.

Las primeras descripciones del mundo microbiano se centraron en la morfología y los patrones de motilidad de los "animálculos"1. En los siglos transcurridos desde el descubrimiento revolucionario de van Leeuwenhoek, se ha descrito una gran diversidad de formas microbianas, que van desde las bacterias con forma de estrella del género Stella2,3 hasta los cuerpos fructíferos multicelulares característicos del orden Myxobacterales4,5. La morfología es una característica biológicamente importante, a menudo muy conservada y moldeada con el tiempo por las presiones selectivas resultantes del estilo de vida y el contexto ambiental de un organismo6. De hecho, la morfología celular juega un papel importante en la motilidad, la adquisición de nutrientes, la división celular y las interacciones con otras células, incluidas las simbiosis con los huéspedes, todos los cuales son fuertes determinantes de la supervivencia7. Como tal, los estudios morfológicos y estructurales ofrecen una ruta atractiva para obtener información sobre las formas de vida microbiana y los mecanismos por los cuales las especies funcionan y afectan sus entornos. Además, la caracterización de las estructuras y funciones de la diversa gama de microbios en las ramas desconocidas del árbol de la vida brinda la oportunidad de ampliar nuestra comprensión de la evolución y puede dar lugar a innumerables aplicaciones en biotecnología y medicina, ejemplificadas por el desarrollo de la optogenética8 y CRISPR- edición de genes basada9.

La genómica sirve como una poderosa lente a través de la cual describir el mundo microbiano. En los últimos años, los análisis metagenómicos y genómicos unicelulares han aumentado sustancialmente el número de linajes conocidos a nivel de filo microbiano en un factor de casi cuatro en el dominio bacteriano10,11,12,13. La secuenciación de los genomas de organismos recién descubiertos ha llevado al descubrimiento de nuevos sistemas funcionales, tipos de variantes de proteínas y estilos de vida11,14,15,16,17, lo que ilustra la correlación entre la diversidad filogenética y el potencial funcional18. Sin embargo, la aplicabilidad de dichos enfoques se limita principalmente a proteínas y sistemas reguladores homólogos a los de organismos bien caracterizados; la predicción de fenotipos y funciones realmente novedosos y/o cuya base genética se desconoce generalmente requiere conocimientos complementarios. Dada la recalcitrancia de la mayoría de las especies microbianas de la Tierra al cultivo en laboratorio (en 2016, el 72 % de los linajes a nivel de filos aproximadamente carecían de algún representante cultivado)19, los métodos que no requieren aislamientos cultivados, como la microscopía, ofrecen una ruta atractiva y complementaria por que estudiar nuevas propiedades morfológicas y funcionales de linajes no cultivados. Por ejemplo, los avances recientes en microscopía electrónica criogénica (cryoEM) y tomografía (cryoET) han permitido obtener imágenes tridimensionales (3D) de células bacterianas intactas con una resolución de unos pocos nanómetros20, lo que ha dado lugar a importantes avances en el descubrimiento y la caracterización de nuevos microbios. estructuras21,22. En la actualidad, nuestro conocimiento de la biología celular se ha limitado en gran medida a la observación y experimentación de bacterias que pueden cultivarse y, por lo tanto, existe un sesgo severo en nuestra comprensión hacia los organismos que conducen al crecimiento en condiciones de laboratorio. El uso de microscopía y técnicas no basadas en secuenciación para estudiar "la mayoría no cultivada" será esencial para caracterizar toda la diversidad de estilos de vida bacterianos que han evolucionado, en particular los esfuerzos para caracterizar bacterias en entornos relativamente no estudiados, como la cavidad oral de la nariz de botella. delfines (Tursiops truncatus), que albergan una rica colección de nuevos microbios y potencial funcional16,23.

A pesar de la diversidad de formas de las células microbianas, las estructuras rectangulares son una rareza, con una base genética poco conocida. Tales estructuras son de dos tipos: celdas individuales que son rectangulares y agregados de celdas que forman rectángulos. Hasta donde sabemos, el descubrimiento de células rectangulares no eucariotas hasta ahora se ha restringido a la familia Halobacteriaceae, que consiste en Archaea halófilas. Las células rectangulares conocidas de esta familia incluyen Haloquadratum walsbyi24, Haloarcula quadrata25 y miembros del género pleomórfico Natronrubrum26. La fisión basada en FtsZ se ha observado recientemente en el simbionte del nematodo en forma de cubo Candidatus Thiosymbion cuboideus27 y se han descubierto células rectangulares adicionales que se cree que son bacterianas o arqueas en ambientes de alta salinidad pero que no se han identificado taxonómicamente28. Entre los microorganismos eucariotas, las diatomeas pueden tener una apariencia rectangular cuando se visualizan en dos dimensiones, aunque estas células son prismas cilíndricos en lugar de rectangulares29. Una variedad de bacterias forman grupos de células rectangulares, como láminas de bacterias cocoides (p. ej., Thiopedia rosea y el género Merismopedia30), estructuras cúbicas de bacterias cocoides (p. ej., los géneros Sarcina y Eucapsis30) y tricomas rectangulares formados por bacterias en forma de disco. (p. ej., Oscillatoria limosa y otras cianobacterias30).

También son raras en el mundo microbiano las células que divergen del patrón típico de división celular a lo largo de un eje transversal. Dos ejemplos espectaculares son Candidatus Thiosymbion oneisti y Candidatus Thiosymbion hypermnestrae31,32,33, que se han encontrado exclusivamente en la superficie de nematodos marinos. Se cree que este patrón de división preserva el apego al anfitrión31,32. De manera similar, los miembros de la familia Neisseriaceae géneros Alysiella, Simonsiella y Conchiformibius se dividen longitudinalmente, lo que se cree que ayuda con la adherencia a las células epiteliales humanas en la cavidad bucal34. Estos taxones son aún más llamativos porque pueden considerarse bacterias multicelulares. Ejemplos adicionales de bacterias que se dividen longitudinalmente incluyen Spiroplasma poulsonii35 y el género Candidatus Kentron, un clado de simbiontes hospedados por el ciliado marino Kentrophoros36,37. Tal conocimiento de los métodos reproductivos de diversas bacterias es esencial para construir una comprensión integral de la biología celular.

Aquí, descubrimos estructuras bacterianas rectangulares inusuales (RBS) en muestras orales de delfines y caracterizamos sus dimensiones celulares y patrones de ADN mediante microscopía de fluorescencia y contraste de fase. Las bandas regulares de ADN sugieren que las unidades son láminas de células individuales, cada una de las cuales está encapsulada por una membrana interna y otra externa, mientras que los experimentos de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) y la secuenciación metagenómica sugieren fuertemente que son bacterias y miembros potenciales de la clase. Betaproteobacteria. Usando microscopía electrónica de transmisión criogénica (cryoTEM) y cryoET, caracterizamos la estructura de la envoltura de los RBS y descubrimos características superficiales previamente no observadas, como haces heterogéneos de apéndices que sobresalen de los extremos de los RBS y se extienden en las puntas. Estos hallazgos destacan el poder de la microscopía de alta resolución para explorar la naturaleza de los microbios no cultivados.

Se recolectaron muestras de hisopos orales de la boca de ocho delfines nariz de botella (Tursiops truncatus) bajo el control del Programa de Mamíferos Marinos (MMP) de la Marina de los EE. UU. en la Bahía de San Diego, California, EE. UU., durante tres intervalos distintos en 2012, 2018 y 2022 ( Métodos). Los RBS eran fácilmente evidentes en las imágenes de microscopía de contraste de fase (Fig. 1a-e). Los RBS parecían prismas rectangulares; no eran cilíndricos (Película complementaria 1). Exhibían características Gram-negativas después de la tinción de Gram (Fig. 1f). Los intentos de teñir la membrana con FM4-64 no tuvieron éxito, ya que el colorante FM4-64 no tiñó ninguna parte de los RBS. Los RBS contenían múltiples bandas paralelas de fluorescencia con tinción DAPI (Fig. 1b-e). En algunos RBS, los pares de bandas de ADN vecinos aparecían en forma de "H" (Fig. 1g, flecha blanca), lo que sugiere dos células en forma de varilla en el proceso de división a lo largo de un eje longitudinal con las bandas de ADN experimentando segregación27. Los RBS se agruparon en dos morfotipos según las dimensiones de las unidades rectangulares (Fig. 1h). Usando materiales de una sola muestra de hisopo oral de delfín, cuantificamos la longitud y el ancho de 23 RBS. El morfotipo A mostró una longitud media de 3,95 ± 2,89 µm de desviación absoluta media (MAD) y una anchura media de 5,08 ± 0,10 µm MAD (n = 15 RBS). El morfotipo B tenía una longitud media de MAD de 3,08 ± 0,93 µm y una anchura media de MAD de 2,21 ± 0,56 µm (n = 8 RBS). Las dimensiones de largo y ancho fueron significativamente diferentes entre los dos morfotipos (para largo, p = 0.02; para ancho, p = 10−10; prueba t de Welch bilateral). Los diferentes morfotipos pueden representar diferentes tipos de células o grupos taxonómicos (p. ej., cepas o especies), células en diferentes etapas de desarrollo o células con forma alterada en respuesta a condiciones ambientales.

a Imágenes de contraste de fase de RBS (la flecha indica un ejemplo) en la superficie de células epiteliales orales de delfín. Consulte también la película complementaria 1. b, c Algunos RBS exhibieron bandas largas de fluorescencia DAPI. La imagen de contraste de fase se muestra en (b), con superposición de fluorescencia en cian en (c). d, e Otros RBS exhibieron bandas DAPI más cortas. La imagen de contraste de fase se muestra en (d), con superposición de fluorescencia en cian en (e). Las manchas oscuras (flechas) se organizaron en líneas perpendiculares a las bandas teñidas con DAPI. Las bandas teñidas con DAPI parecían estar organizadas en pares. f Los RBS teñidos con Gram muestran características Gram-negativas. Recuadro: Bacillus subtilis teñido con Gram (Bs, Gram-positivo) y Escherichia coli (Ec, Gram-negativo). g Los pares de bandas de ADN vecinas en un RBS forman formas similares a "H" (flecha), probablemente porque las bandas de ADN son nucleoides segregados en una célula que experimenta división longitudinal. h Los dos morfotipos RBS tienen distintas distribuciones de largo y ancho. La anchura y la longitud medianas de 15 RBS-A midieron 3,95 ± 2,89 µm MAD y 5,08 ± 0,10 µm MAD, respectivamente, y para 8 RBS-B midieron 3,08 ± 0,93 µm MAD y 2,21 ± 0,56 µm MAD, respectivamente. Los centros de las cruces naranja y azul representan las medias de RBS-As y RBS-Bs, respectivamente, mientras que las longitudes de los brazos representan ±1 desviación estándar.

Evaluamos la prevalencia de RBS de cada morfotipo en un conjunto de 73 muestras de hisopos orales recolectadas de ocho delfines (Datos complementarios 1) utilizando un flujo de trabajo de microscopía de contraste de fase automatizado de alto rendimiento que recolectó datos de imágenes para 226 campos de visión por muestra38. Se detectaron RBS del morfotipo A, en lo sucesivo denominados RBS-A, en 39/73 muestras de 7/8 delfines (tenga en cuenta que el número de muestras por delfín no es constante y que se tomaron muestras de diferentes ubicaciones orales en diferentes años). Se detectaron RBS del morfotipo B, en lo sucesivo denominados RBS-B, en 42/73 muestras de 6/8 delfines. De 25 de estas 73 muestras que se recolectaron de distintos sitios orales, se detectaron RBS en muestras palatinas (RBS-A = 5/5; RBS-B = 4/5) y gingivales (RBS-A = 12/15; RBS- B = 14/15), pero con menor frecuencia en muestras bucales (RBS-A = 0/5; RBS-B = 2/5). Por lo tanto, inferimos que los RBS son colonizadores estables en la cavidad oral de los delfines y tienen lugares de colonización preferidos.

En este estudio, nos enfocamos en RBS-A, ya que este morfotipo tenía una mayor abundancia en las muestras orales de delfines y es morfológicamente más distinto de otros microbios conocidos.

Dada la intrigante morfología de los RBS, a continuación buscamos determinar su afiliación taxonómica. Los RBS se asemejan morfológicamente a los miembros de los géneros Simonsiella y Conchiformibius (familia Neisseriaceae), que son comensales orales en forma de bastón en los mamíferos39. En un nuevo análisis de la biblioteca de clones de Sanger y 454 datos de pirosecuenciación de un estudio previo de amplicón del gen 16S rRNA de muestras de hisopos gingivales de 38 delfines de la misma población23, no se encontró S. muelleri (la única especie del género Simonsiella) ni del género Conchiformibius Se detectaron amplicones en cualquiera de estas muestras, aunque se detectaron otros miembros de la familia Neisseriaceae en estas muestras orales de delfines. Se detectó un tipo de secuencia putativo de S. muelleri en la biblioteca de Sanger de la boca y el fluido gástrico de un león marino examinado en el mismo estudio de amplicón23 (número de acceso NCBI JQ205404.1); esta secuencia parcial del gen 16S rRNA tiene una identidad del 94,6 % sobre una cobertura de consulta del 99 % con la secuencia parcial del gen 16S rRNA de S. muelleri ATCC 29453 (número de registro NCBI NR_025144.1). El estudio anterior detectó otros cinco tipos de secuencias de la familia Neisseriaceae en la biblioteca de Sanger de leones marinos (boca y estómago), agua y especies de peces que alimentan a los mamíferos marinos23. Mientras tanto, se recuperaron cuatro tipos de secuencias de la familia Neisseriaceae en el estudio de pirosecuenciación 454, de delfines (estómago, sistema respiratorio), leones marinos (boca, estómago), peces y agua de mar. Estas identificaciones positivas indican que el ADN de S. muelleri y la familia Neisseriaceae se pudo extraer con éxito en el estudio anterior, aunque no se detectaron en ninguna muestra oral de delfines23.

Luego realizamos la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA en 54 muestras orales de delfines (Métodos), lo que resultó en la detección de 1 116 394 variantes de secuencia amplificada (ASV) de 5 339 751 lecturas de secuencia. De estas 54 muestras, 48 ​​se examinaron de manera de alto rendimiento para RBS a través de microscopía de contraste de fase (Métodos). RBS-As y RBS-Bs se detectaron cada uno en 22/48 muestras (45,8%), pero no en las mismas 22 muestras. Se detectó uno u otro morfotipo en 30/48 muestras (62,5%). Las curvas de rarefacción sugirieron que la profundidad de la secuenciación fue suficiente para que los resultados estuvieran cerca de la saturación de la riqueza de ASV (Fig. 2a). No se detectaron amplicones de la familia Neisseriaceae en estas muestras (Fig. 2b), a pesar de nuestra capacidad para recuperar secuencias de S. muelleri de muestras de hisopos orales previamente negativas después de añadir deliberadamente alícuotas de estas muestras con S. muelleri. Los ASV comunes a las muestras positivas de RBS-A y RSB-B se pueden ver en las Tablas complementarias 1 y 2, respectivamente.

Las muestras orales de delfines (n = 54) se sometieron a una secuenciación profunda del amplicón del gen 16S rRNA. a Curvas de rarefacción para las 54 muestras orales de delfines secuenciadas. b Para cada familia de clase Betaproteobacteria detectada en las 54 muestras orales de delfines, se representa gráficamente la abundancia relativa de miembros ASV. Nótese que el género Simonsiella es miembro de la clase Betaproteobacteria, familia Neisseriaceae; no se detectaron ASV afiliados a esta familia. El examen visual con microscopía de contraste de fase (ver Métodos) reveló RBS de morfotipo A o B en 39 de 73 muestras analizadas (tenga en cuenta que en total 73 muestras se examinaron visualmente para RBS; 54 se usaron para la secuenciación de amplicón, mientras que el resto se usaron para otros experimentos) (Datos complementarios 1). c La secuenciación de un cultivo puro de S. muelleri y una muestra oral de delfín (que se confirmó que contenía RBS-As) con S. muelleri enriquecido dio como resultado la detección de un ASV de la familia Neisseriaceae. El mismo ASV se detectó con una abundancia relativa de <0,1 % en esa misma muestra oral de delfín en su estado inalterado (sin adición de S. muelleri) cuando se preparó y secuenció en paralelo con las muestras positivas de S. muelleri; el ASV no se detectó en ninguna muestra oral de delfín antes de la introducción de S. muelleri en el entorno del laboratorio.

El origen marino y la naturaleza rectangular de los RBS también dieron lugar a la especulación de que pueden ser diatomeas marinas (p. ej., Skeletonema costatum), ya que las diatomeas marinas cilíndricas pueden aparecer rectangulares en dos dimensiones. Por lo tanto, a continuación evaluamos un origen eucariótico potencial de los RBS. Realizamos FISH utilizando sondas eucarióticas (Euk-1209) y bacterianas (Eub-338) marcadas, la última de las cuales se sabe que se hibrida con bacterias y arqueas. Como controles, cultivamos e incluimos S. costatum y la bacteria Escherichia coli. La sonda Eub-338 se hibridó tanto con E. coli como con los RBS, mientras que la sonda eucariota Euk-1209 se hibridó con células de S. costatum solas (Fig. 1 complementaria), lo que indica que los RBS no son eucariotas y, por lo tanto, no son diatomeas.

Sin más hipótesis a priori sobre la naturaleza específica de las RBS, buscamos una variedad de enfoques generales para arrojar luz sobre su identidad. En primer lugar, cultivamos muestras orales en condiciones aeróbicas y anaeróbicas en tres medios utilizados para cultivar diversas bacterias (Métodos), con la esperanza de enriquecer las RBS. Desafortunadamente, los RBS no fueron visibles al inspeccionar los cultivos bajo un microscopio, lo que indica que los requisitos de crecimiento para los RBS son distintos de los de las bacterias típicas aisladas de la microbiota de los mamíferos.

Exploramos más a fondo el potencial para cultivar RBS directamente en superficies sólidas. Entre las muestras de hisopos de 2022, almacenamos cinco en glicerol al 20 % inmediatamente después de la recolección para maximizar las posibilidades de mantener la viabilidad de RBS. La microscopía unicelular identificó dos stocks de glicerol que contenían muestras con numerosos RBS. Estos stocks se inocularon en placas de agar que contenían medio BSTSY-FBS o BHI-sangre (Métodos). Las placas BSTSY-FBS permiten el crecimiento de S. muelleri y se incubaron aeróbicamente a 37 °C. Las placas de sangre BHI se utilizan típicamente para cultivar una variedad de bacterias comensales de mamíferos; estas placas se incubaron anaeróbicamente a 37 °C. Después de 3 semanas de incubación prolongada, no se observaron colonias en las placas BSTSY-FBS, mientras que una muestra de control de S. muelleri formó colonias grandes después de 1 a 2 días. Las placas de sangre BHI contenían colectivamente ~300 colonias, de las cuales examinamos 288 usando microscopía unicelular de alto rendimiento38. Ninguna de las colonias contenía células con morfología similar a las RBS. En conjunto, si bien es decepcionante desde el punto de vista de permitir enfoques genómicos, nuestra incapacidad para cultivar RBS brinda más apoyo de que no son S. muelleri, que es fácilmente cultivable utilizando tales enfoques.

Nuestra siguiente estrategia empleó mini-metagenomics, un enfoque en el que se submuestrea una pequeña cantidad de células de una comunidad compleja y su ADN se amplifica mediante amplificación de desplazamiento múltiple (MDA). En particular, este enfoque evita en gran medida los sesgos preconcebidos sobre la posible identidad, ya que los análisis metagenómicos deberían revelar el ADN de cualquier célula de cualquier dominio de la vida, suponiendo que la lisis celular sea exitosa. Utilizamos tres técnicas para capturar RBS-As para la secuenciación genómica: microdisección de captura láser, microfluídica y micromanipulación celular. Debido a su gran tamaño en comparación con otras bacterias, baja densidad y la propensión de RBS-As a adherirse a otras células y superficies abióticas, solo la micromanipulación condujo a una captura exitosa de RBS-A (Fig. 1 complementaria). Además de cuatro tubos de recolección, cada uno con ~1–3 RBS-As, se recolectaron cuatro tubos de control negativo de fluido de muestra con la micropipeta sin células visibles a la resolución de nuestro microscopio. Probablemente también se recolectaron ADN libre de células y células pequeñas no diana junto con los RBS-As, dada la frecuente proximidad de los RBS-As a otras células. El ADN de las muestras RBS-A-positivas y RBS-negativas se amplificó usando MDA, se coensambló y se clasificó en 18 contenedores de genoma (Fig. 3 complementaria y Tablas complementarias 3 y 4; Métodos). En particular, no se recuperaron genomas de S. muelleri, familia Neisseriaceae o diatomeas, aunque los controles positivos para estos taxones no se incluyeron en el diseño experimental. Los contenedores eucarióticos coincidían con el genoma humano o con la clase de hongos Malasseziomycetes, cuyos miembros son comensales conocidos de la piel humana40 y, por lo tanto, pueden representar contaminantes. No se recuperaron contenedores de arqueas.

Como la mitad de los contenedores bacterianos candidatos recuperados del experimento de mini-metagenómica eran miembros del filo Proteobacteria, a continuación realizamos experimentos FISH utilizando un conjunto de sondas específicas de clase dirigidas a proteobacterias alfa, beta y gamma. Los RBS exhibieron una unión positiva solo a las sondas de clase Betaproteobacteria (Fig. 3).

Se evaluaron las sondas para las clases de filo Proteobacteria Alphaproteobacteria (ALF968), Betaproteobacteria (BET42a) y Gammaproteobacteria (GAM42a) en cuanto a su capacidad para hibridar con RBS. Fila superior: imágenes de contraste de fase; tres filas centrales de arriba a abajo: imágenes de fluorescencia para sondas de clase Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria y Gammaproteobacteria, respectivamente; fila inferior: tinción DAPI de ADN presunto. Las flechas resaltan las celdas relevantes en las muestras. Los RBS del morfotipo "A" (Fig. 1h) se hibridaron con la sonda de clase Betaproteobacteria y exhibieron una hibridación mínima con las sondas de clase Alphaproteobacteria y Gammaproteobacteria.

Sintetizamos información sobre la identidad taxonómica de RBS-A de cada línea experimental de evidencia (Fig. 4). Si bien no se pueden extraer conclusiones concluyentes sobre la identidad de RBS-A, los resultados de FISH sugirieron una afiliación con la clase Betaproteobacteria, y se recuperó un solo genoma parcial de la clase Betaproteobacteria de los experimentos de mini-metagenómica; la afiliación de este contenedor (número 16) con la familia Alcaligenaceae se confirmó mediante un análisis filogenético de los genes 16S rRNA y proteína ribosomal S3 (Figuras complementarias 4 y 5 y Métodos). Un ASV compatible con el gen 16S rRNA de ese bin está presente en 11/13 de las muestras en las que se confirmó visualmente la presencia de RBS-A y para las que se dispone de datos de secuenciación de amplicón.

La tabla muestra los 18 contenedores recuperados de MDA y la secuenciación de muestras de RBS-A recolectadas a través de un micromanipulador, junto con el filo del que se infiere que derivan. Para la identidad taxonómica más baja lograda (o clase, en el caso del filo polifilético Proteobacteria), un asterisco (*) indica una menor confianza en la asignación (Métodos). El panel RBS-A muestra la abundancia relativa de contenedores en cada una de las cuatro muestras que contenían RBS-A según la visualización, codificados por colores de la siguiente manera: verde: ≥5 %, amarillo: ≥1 % y <5 %, naranja: > 0% y <1%, rojo: 0%. El panel de control negativo (Neg) presenta la misma información para cada una de las muestras que no parecían contener RBS-As. Se muestran los criterios para medir la probabilidad de que un contenedor se derive de los RBS-A: (Genómica) ¿Estuvo el contenedor alguna vez presente en los controles negativos (verde = no, amarillo = sí pero nunca ≥1 % de abundancia relativa, naranja = sí pero nunca ≥ 5%, rojo = sí y al menos una vez ≥5%)? (Tinción de Gram) ¿Se sabe que los miembros de este grupo taxonómico son Gram-negativos, como los RBS? (16S 75%+) De los ASV detectados en >75% de las muestras que se sometieron a la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA y se confirmó visualmente que contenían >10 RBS-As (n = 13), ¿era un ASV de esta identidad taxonómica? Los números en los recuadros indican el número de muestras en las que estaba presente este ASV. Para contenedores recuperados detectados solo hasta el nivel de clase Gammaproteobacteria, un grupo grande y diverso, este criterio está marcado en amarillo y no se muestran los recuentos de ASV. (FISH) Según los resultados de FISH, ¿qué contenedores se admiten como candidatos potenciales para los RBS-A? Una cruz (†) indica que se deduce que los miembros del filo Gracilibacteria no son gramnegativos a partir de estudios genómicos (aunque no necesariamente son grampositivos)92. Los candidatos de mayor probabilidad son verdes para los tres criterios.

El camino evolutivo hacia la multicelularidad y la división longitudinal es poco conocido. Esfuerzos recientes para identificar la base genética de estas características bacterianas en la familia Neisseriaceae encontraron que la adquisición del gen amiC2 que codifica la amidasa, junto con modificaciones en genes reguladores clave (p. ej., mreB, ftsA), probablemente desempeñe un papel importante. Buscamos en los contenedores recuperados del experimento de minimetagenómica proteínas AmiC2 putativas (aquellas que codifican Amidasa_3, PF01520); se identificaron candidatos en los contenedores 4, 7, 9, 10, 11, 12 y 16 (el último de los cuales está afiliado a Alcaligenaceae). Tras la confirmación de la identidad de los RBS, el trabajo futuro debería examinar la importancia de amiC2 para conferir su morfología inusual.

Para obtener información estructural de alta resolución sobre RBS-As, tomamos imágenes de muestras orales de delfines que contenían altas densidades de RBS-As utilizando cryoTEM. Las imágenes cryoTEM de bajo aumento revelaron que cada RBS-A consta de segmentos aparentemente emparejados organizados en paralelo (Fig. 5a, b). Estos segmentos se orientaron de manera similar a las bandas teñidas con DAPI que se ven en las imágenes de microscopía de fluorescencia (Fig. 1c, e). Algunos grupos de segmentos parecían estar en el acto de separarse de otros grupos, aunque nuestros datos estáticos no pueden decir definitivamente si estas observaciones reflejaban la división celular. Los segmentos estaban rodeados por una capa densa similar a una membrana debajo de una capa de baja densidad (Fig. 6a, b (derecha) y Fig. 7a; Películas complementarias 2 y 3).

Imágenes a, b de bajo aumento filtradas y sin ruido de paso de banda o imágenes crioTEM de montaje c de RBS en una cuadrícula TEM de carbono perforada R2/2. Imágenes de mayor aumento que muestran d apéndices similares a pilus y e células proximales y vesículas que interactúan en la periferia de RBS. En (a), los pares de segmentos se resaltan con tonos alternos de azul, y las muescas pronunciadas entre grupos de segmentos se indican con flechas negras. Los objetos esferoidales densos estaban presentes dentro de los RBS (flecha blanca). En (d), los segmentos están encapsulados por una membrana interna (IM) y una membrana externa (OM), indicadas por flechas negras. d, e Micrografías representativas que muestran que los RBS a menudo estaban muy cerca físicamente de otras células en las muestras. En (e), una pequeña muesca aparente (flecha negra) en la superficie periódica de RBS se superpone con una célula o vesícula que no es RBS. Los pequeños puntos oscuros (15 nm) en (c-e) son partículas fiduciales de oro utilizadas para la alineación de series de inclinación en experimentos cryoET (flecha negra).

a, b, d, e Ejemplos de cortes de ~3 nm de espesor a dos profundidades diferentes (a versus b, d versus e) de cada uno de dos tomogramas RBS-A representativos. c, f Anotaciones manuales correspondientes de características celulares. Los tomogramas son gruesos (~500–600 nm) y, como tales, los apéndices en forma de pilus (amarillo: c, f) solo eran visibles a cierta profundidad dentro de la densidad del volumen tomográfico del RBS-A. Consulte también las Películas complementarias 2 y 3. c, f Azul, membranas internas; púrpura, cobertura periódica de la superficie; verde, membrana exterior; rojo, matriz. Barras de escala, 100 nm.

una sola imagen cryoTEM. b, c Rebanadas CryoET (~ 3 nm de espesor) de un RBS-A. Los recuadros rojo y naranja en (c) son vistas ampliadas de haces de apéndices, y las flechas indican apéndices delgados y únicos. d Imagen crioTEM 2D representativa en el borde de un RBS-A que muestra una cubierta de superficie periódica. e Los perfiles de densidad de línea a lo largo de regiones seleccionadas de la imagen en (d) muestran que el espaciado de las características repetitivas es de ~7 a 9 nm a lo largo de una dirección paralela a la membrana RBS-A.

Presumimos que los RBS son probablemente agregados de células, con cada segmento que contiene ADN correspondiente a una célula individual. Las siguientes observaciones respaldan esta hipótesis: (1) cada segmento individual parecía estar rodeado por una membrana interna y externa, que recuerda el plasma y la membrana externa que se ven en otras bacterias Gram-negativas (Figs. 5a, 6a, b (derecha) y 7a); (2) los segmentos están dispuestos en la misma geometría (Fig. 5a, b) que las bandas teñidas con DAPI y las bandas hibridadas con sonda FISH (Figs. 1c, e, g y 3); (3) apéndices que sobresalían de la superficie de los segmentos individuales (Fig. 5c, d); (4) RBS-As a menudo consistía en un número variable de segmentos que parecían estar separándose entre sí (Figs. 1d, e y 6d, e), lo que sugiere que las estructuras rectangulares no reflejan celdas individuales; (5) los segmentos vecinos aparecían en forma de H (Fig. 1g), que recuerdan a los nucleoides que se segregan en una célula bacteriana en división longitudinal; y (6) si bien un informe reciente describe el primer descubrimiento de una bacteria en la que el ADN se almacena en un compartimento unido a una membrana41, el número de especies bacterianas conocidas en las que el ADN se segrega físicamente del citoplasma, y ​​mucho menos unido a orgánulos, es extremadamente bajo. Por el contrario, la multicelularidad se ha documentado en diversas especies bacterianas (revisado en la ref. 42).

Las estructuras esféricas oscuras eran visibles en el cuerpo de los RBS en las imágenes cryoTEM (Fig. 5c). En un tomograma, dos objetos esferoidales densos eran prominentemente visibles y midieron 192 nm × 200 nm × 192 nm (volumen 3,1 × 107 nm3) y 215 nm × 220 nm × 220 nm (volumen 4,4 × 107 nm3). También eran evidentes estructuras similares a vesículas. En particular, una superficie que cubre con una periodicidad de ~ 7–9 nm encapsuló los RBS-As (media 7.83 ± 0.86 nm SD) (Figs. 6 y 7 y Películas complementarias 2 y 3). Esta característica se midió a partir de micrografías 2D de alta resolución de dos RBS-A de una sola muestra oral de delfín generando gráficos de densidad de línea de segmentos (2 de cada imagen) y midiendo manualmente la distancia entre los picos de intensidad para 6–7 picos ( Figura 7d, e).

Para obtener reconstrucciones 3D más detalladas de las características de RBS-A, realizamos experimentos cryoET. Las adquisiciones de la serie de inclinación se limitaron a la periferia de RBS-A ya que el grosor de los cuerpos de RBS-A ocluía el haz de electrones casi por completo en ángulos de inclinación altos. El grosor en la periferia de RBS-A (<1 μm desde el borde) osciló entre ~323 y 751 nm, con un valor promedio de ~509 ± 132,4 nm SD (n = 15), (por encima del umbral de ~500 nm comúnmente considerado como el límite superior para imágenes crioET productivas43). Los intentos de obtener imágenes del cuerpo RBS-A con cryoET fallaron porque los fiduciales de oro y las características celulares se volvieron rápidamente imperceptibles al inclinarlos, lo que sugiere que el grosor de la muestra indujo demasiados eventos de dispersión múltiple44.

Apéndices que parecían pili45,46 sobresalían de RBS-As; estos apéndices a menudo consistían en estructuras similares a cabellos que formaban haces y se extendían en las puntas, a veces entrelazándose y/o cruzándose entre sí (Figs. 6b y 7b, c). Los paquetes de apéndices eran estructuralmente heterogéneos, con longitudes, anchos de paquetes y números de puntas variables. En particular, al examinar las diversas características dentro de los tomogramas, no observamos ningún orgánulo unido a la membrana que recordara un núcleo, en línea con una identidad no eucariota.

Tanto para los apéndices como para la cobertura periódica de la superficie, el promedio de subtomogramas47 no arrojó mapas consistentes, probablemente debido al grosor de la periferia de RBS-A (a menudo >500 a 600 nm de grosor), la baja relación señal-ruido de los tomogramas y características limitantes de las características en cuestión, como la curvatura variable de las regiones con tramos de cobertura superficial periódica continua. El promedio exitoso de subtomograma generalmente se basa en promediar estructuras idénticas, por ejemplo, copias repetidas de un complejo macromolecular, como ribosomas en el mismo estado funcional. Se puede compensar la variabilidad estructural en forma de heterogeneidad conformacional y compositiva con grandes conjuntos de datos compuestos por miles de subtomogramas en combinación con métodos de clasificación avanzados. Sin embargo, en nuestros conjuntos de datos, tanto los apéndices con forma de pilus (Fig. 7a-c) como la característica de superficie con forma de capa S (Fig. 7a, d, e) eran estructuralmente heterogéneos y escasamente distribuidos en el RBS-As (p. ej. , la característica de la superficie similar a una capa S no es continua a lo largo de toda la membrana del RBS-As, y en los tramos donde lo es, exhibe una curvatura diferencial) y, por lo tanto, se observaron solo en una fracción de nuestros tomogramas.

Para abordar el grosor de la muestra, utilizamos microscopía electrónica de barrido (SEM) de haz de iones enfocados criogénicos (FIB)48 para moler láminas más delgadas de muestras de RBS49. Sin embargo, no pudimos ubicar ningún RBS-A debajo del hielo, por dos posibles razones: (1) con un espesor inferido entre ~0.6 y 1.7 µm, es posible que los RBS-A no formen "montículos" debajo del hielo que sean lo suficientemente protuberantes como para sugerir dónde fresar; y (2) otras células más grandes en las muestras (como las células epiteliales de delfín) formaron montículos más prominentes que oscurecieron las RBS-A. De hecho, ninguna de las láminas que produjimos de las ubicaciones candidatas contenía RBS-A. Los datos de este experimento sugieren que la microscopía de luz y electrónica criocorrelativa (cryoCLEM) será necesaria en estudios futuros para ubicar regiones candidatas en rejillas cryoEM con RBS-A vitrificados a partir de las cuales producir láminas delgadas usando cryoFIB-SEM. No obstante, la superficie celular exhibió características similares a las que observamos en la periferia de RBS-A, a saber, pili y S-layers. Sugerimos que los apéndices similares a pilus y la cubierta superficial periódica similar a una capa S de RBS-As merecen una investigación futura.

Aquí, utilizamos microscopía óptica, cryoTEM y cryoET para buscar una nueva diversidad morfológica dentro de la microbiota de muestras orales de delfines. La diversidad morfológica se predijo en base a hallazgos previos de nueva diversidad filogenética y potencial funcional en la boca del delfín a través de estudios basados ​​en secuenciación16,23. Curiosamente, descubrimos RBS inusuales. Inferimos que ambos morfotipos de RBS son autóctonos de la boca del delfín, dado que estuvieron presentes de forma constante en este entorno: RBS-As y RBS-Bs se identificaron en 39/73 y 42/73 muestras, respectivamente, que se examinaron con un alto rendimiento. imágenes de microscopía, incluso en delfines 7/8 y 6/8 incluidos en este estudio, y estuvieron presentes en muestras recolectadas durante intervalos de diez años. Estudios previos han encontrado que la microbiota de los mamíferos marinos es distinta de la del agua de mar (incluso la de la piel, que está constantemente en contacto directo con el agua de mar)23,50 y, por lo tanto, es poco probable que los RBS sean simplemente contaminantes del agua de mar.

La identificación taxonómica de morfotipos celulares específicos de comunidades complejas puede ser extremadamente difícil, hasta el punto de que muchas veces queda sin resolver28,51,52. Los resultados recopilados aquí sugieren fuertemente que los RBS-A no están afiliados a los miembros multicelulares de la familia Neisseriaceae que se dividen longitudinalmente, S. muelleri, género Conchiformibius o género Alysiella, que también pueden formar grupos rectangulares de células similares a varillas53. En primer lugar, el flujo de trabajo de secuenciación de amplicón del gen marcador empleado aquí no detectó ningún amplicón de la familia Neisseriaceae en 54 muestras orales de delfines que se sometieron a una secuenciación profunda de amplicón del gen 16S rRNA, aunque este flujo de trabajo sí detectó S. muelleri después de que las células de este taxón se agregaran intencionalmente en alícuotas de muestras orales de delfines. En segundo lugar, fracasaron los intentos de cultivar RBS-A utilizando técnicas que se emplearon con éxito en nuestro laboratorio para cultivar S. muelleri, lo que sugiere que los RBS-A tienen requisitos fisiológicos de crecimiento diferentes a los que requiere S. muelleri. En tercer lugar, no se recuperaron genomas de la familia Neisseriaceae del experimento de mini-metagenómica. En cuarto lugar, las comparaciones visuales de las imágenes RBS-A presentadas aquí con las imágenes de microscopía de fluorescencia y TEM de la familia Neisseriaceae multicelular que se divide longitudinalmente (géneros Alysiella, Simonsiella y Conchiformibius) en la ref. 53 sugieren que son taxones diferentes. Por ejemplo, los RBS parecen contener segmentos (células) que están incrustados en un material similar a una matriz y completamente encapsulados por una estructura similar a una capa S, mientras que la familia Neisseriaceae multicelular que se divide longitudinalmente y que pertenece al mismo filamento solo parece compartir su membrana externa53 .

Los experimentos FISH indicaron que los RBS-A son bacterias y probablemente miembros de la clase Betaproteobacteria. Se recuperó un genoma de clase Betaproteobacteria del experimento de mini-metagenómica de la familia Alcaligenaceae. Se detectó un ASV que coincidía con el gen 16S rRNA de este contenedor en 11/13 muestras que se sometieron a secuenciación de amplicón y se confirmó visualmente que contenían RBS-As mediante microscopía de contraste de fase. En conjunto, los RBS-A pueden ser miembros de la familia Alcaligenaceae, aunque el hallazgo de que este ASV estaba ausente en 2/13 muestras confirmadas por microscopía que contenían RBS-A desafía esta hipótesis. Una posibilidad es que los RBS-A estuvieran presentes en una abundancia relativa suficientemente baja en esas dos muestras como para no ser detectados, a pesar de la secuenciación profunda del amplicón. Otra posibilidad es que los RBS-A no sean este taxón de Alcaligenaceae, y más bien el taxón de Alcaligenaceae es un miembro ubicuo de la microbiota oral de los delfines y, por lo tanto, apareció con frecuencia en nuestros análisis basados ​​en secuenciación. En tal caso, sugeriría que las RBS-A son de clase Betaproteobacteria que no se lisaron en los experimentos basados ​​en secuenciación o que los resultados de FISH fueron falsos positivos, a pesar de las condiciones estrictas y controladas en las que se realizó el experimento.

Obtener una identificación a nivel de especie para RBS a través de métodos basados ​​en secuenciación será extremadamente desafiante por numerosas razones, como la proximidad frecuente de RBS con otras células pequeñas que probablemente se mezclaron con RBS durante la micromanipulación o la resistencia a la lisis de laboratorio. Es importante destacar que dudamos en excluir las identidades candidatas en función de no estar presentes en el experimento de mini-metagenómica en todas las muestras positivas de RBS, ya que las limitaciones técnicas podrían haber dado lugar a falsos negativos. Por ejemplo, una pared celular gruesa u obstrucción que impide que los reactivos lleguen al RBS por la aguja de la micropipeta podría haber interferido con la lisis de la membrana celular e impedido la extracción de ADN. Por el contrario, un resultado positivo en un control negativo puede haber surgido debido a un mapeo de lectura no específico, contaminación de los contenedores del genoma con material de contaminantes verdaderos o ADN libre de células. Los enfoques basados ​​en cultivos pueden ser, en última instancia, la ruta más prometedora para identificar RBS, aunque es probable que sea necesario probar muchas combinaciones de parámetros para encontrar condiciones satisfactorias para el crecimiento de RBS. Independientemente de la identidad taxonómica de los RBS, las características estructurales novedosas que han evolucionado en estos microorganismos son intrigantes y resaltan el potencial de descubrimiento para estudios posteriores.

La naturaleza emparejada de los segmentos en los RBS probablemente se puede atribuir a su modo longitudinal de fisión binaria, como se ve en los géneros Alysiella, Simonsiella y Conchiformibius de la familia Neisseriaceae, así como en S. poulsonii, Ca. T. oneisti y Ca. T. hipermnestrae31,32,35,54. En S. muelleri, miembro de la familia Neisseriaceae, se cree que las láminas ayudan a que las células permanezcan ancladas físicamente en la cavidad bucal cuando se desprenden rápidamente las células epiteliales que se desprenden 34. Nuestra hipótesis es que lo mismo puede ser cierto para las RBS, que habitan en un entorno similar y cuya morfología puede haber experimentado una evolución convergente debido a presiones evolutivas similares. La fisión binaria longitudinal puede ser una característica aún más general que se selecciona en respuesta a la necesidad de formar una unión segura a un sustrato. Los segmentos en los extremos de los RBS suelen ser más cortos que los que están más cerca del centro, lo que sugiere que puede haber un mecanismo por el cual el crecimiento de los segmentos está determinado por su posicionamiento espacial dentro de un RBS. Los RBS presentan otro ejemplo de caso para futuros estudios evolutivos centrados en comprender los impulsores y la base genética de la multicelularidad bacteriana y la división longitudinal.

Las imágenes de CryoTEM sugirieron que los RBS-A están encapsulados por una cubierta de superficie periódica, que puede ser una capa S o una nueva estructura cristalina. Las capas S son matrices cristalinas autoensamblables de proteínas individuales o glicoproteínas que recubren el exterior de algunas bacterias y arqueas55,56. Si bien su función exacta varía ampliamente entre los microorganismos y, a menudo, se desconoce, se supone que las capas S confieren funciones beneficiosas dado su alto costo metabólico (la capa S comprende hasta ~20% de la proteína total sintetizada por las células), su ubicuidad a través de microbios, y sus múltiples orígenes evolutivos55,56. Si los segmentos en RBS-As corresponden a células individuales, la producción del revestimiento superficial periódico puede representar una cooperación entre células dentro de RBS-As. La síntesis cooperativa de una sola cubierta de superficie periódica compartida por múltiples células podría haber evolucionado ya que los parientes cercanos (otras células en un RBS-A) tienen una capacidad de dispersión limitada y, por lo tanto, están situadas en estrecha proximidad física. RBS-As se beneficiaría de la producción cooperativa de una sola superficie periódica que cubre alrededor de una población de células en lugar de alrededor de cada segmento individual al reducir el área de superficie requerida para cubrir todas las células, y tal ventaja incluso podría haber contribuido a la selección para la agregación. Una posibilidad adicional y no mutuamente excluyente es que el recubrimiento periódico de la superficie pueda ayudar a mantener la ultraestructura de los segmentos dentro de un RBS-A, similar a las arqueas como Thermoproteus tenax57.

Una de las características más llamativas de los RBS-A son sus apéndices en forma de pilus. En la actualidad, hay cinco clases caracterizadas de pili en bacterias Gram-negativas (chaperone-usher, fibras curli, tipo F, tipo IV y tipo V) y dos tipos generales de pili en bacterias Gram-positivas (varillas cortas y delgadas). y filamentos más largos, flexibles, similares a cabellos)45,46; se han documentado otros apéndices similares a pilus, como hami en archaea21. Hasta donde sabemos, todos los pili bacterianos caracterizados consisten en apéndices únicos que existen como unidades independientes. Por el contrario, los apéndices en forma de pilus que sobresalen de los segmentos RBS-A exhiben una arquitectura inusual que involucra haces heterogéneos de filamentos que a menudo se extienden en las puntas. Estas observaciones plantean la cuestión de si los apéndices RBS-A representan un nuevo tipo de ensamblaje de subunidades de pilina o son una clase de apéndices completamente distinta.

Una extensa investigación de cientos de imágenes cryoEM y docenas de tomogramas cryoET permitió la visualización de la estructura de muchas características de RBS-A con una resolución cercana a los nanómetros. Los estudios futuros de RBS pueden beneficiarse de la obtención de imágenes con óptica de placa de fase que aumenta drásticamente el contraste de la imagen58 siguiendo métodos de preparación de muestras que adelgazan las células en láminas mediante molienda FIB junto con SEM a temperaturas criogénicas48,49. Nuestros datos sugieren que se necesitará cryoCLEM para permitir la producción de láminas delgadas para RBS-As, ya que el cuerpo de la célula RBS-A parece ser más grueso que el límite permitido para los experimentos cryoET y, sin embargo, demasiado delgado para que RBS-As se encuentre fácilmente. por cryoSEM antes de la molienda cryoFIB sin etiquetas fluorescentes. Los experimentos exitosos de cryoCLEM+cryoFIB-SEM seguidos de cryoET podrían permitir análisis más completos de la comunidad de RBS y su cuerpo celular más allá de la periferia delgada, así como la visualización de componentes subcelulares de interés a mayor resolución a través del promedio de subtomogramas.

La gran mayoría de los microorganismos en la Tierra carecen de representantes aislados19. Los análisis basados ​​en secuenciación han demostrado ser invaluables para explorar y describir dicha diversidad, pero no pueden usarse para explorar todos los aspectos de la biología de los microorganismos. Los puntos ciegos notables en nuestra comprensión de los organismos no cultivados incluyen los genes únicos y las características estructurales y funcionales correspondientes que han evolucionado dentro de estos linajes. Si bien el uso de técnicas de imagen avanzadas para visualizar microbios puede proporcionar información sobre la biología de los linajes no cultivados, se requerirá un cambio hacia un enfoque más multifacético basado en muchas disciplinas y técnicas para crear una visión integral de esta materia oscura biológica59,60.

Para maximizar la reproducibilidad, en la Tabla complementaria 5 se proporciona una lista de los reactivos y recursos utilizados en este estudio, así como su fuente e identificador.

Se obtuvieron muestras de hisopos orales de delfines nariz de botella (Tursiops truncatus) administrados por la División de Biociencias MMP de la Marina de los EE. UU., Centro de Sistemas de Guerra Espacial y Naval del Pacífico, San Diego, EE. UU. La muestra más temprana que contenía RBS se recolectó el 1 de abril de 2012 y la última el 24 de marzo de 2022. Las muestras de hisopos se obtuvieron utilizando hisopos de recolección de muestras Catch-All de espuma estéril (Epicenter, WI, Cat. #QEC091H). Las muestras recogidas en 2012 se obtuvieron mediante hisopado del surco gingival izquierdo. Las muestras recolectadas en 2018 se obtuvieron mediante hisopado del paladar, la lengua y el surco gingival izquierdo (las tres superficies para cada hisopado). Las muestras recolectadas en 2022 se obtuvieron del paladar, la superficie bucal o el surco gingival izquierdo. De las 2022 muestras del surco gingival, 5 se almacenaron en glicerol al 20%. Todas las demás muestras de hisopos se congelaron en seco. El protocolo de hisopado se adhirió a las pautas descritas en el Manual de Medicina de Mamíferos Marinos de CRC.

El MMP está acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio Internacional y se adhiere a los estándares nacionales de la Política del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos sobre el Cuidado Humanitario y el Uso de Animales de Laboratorio y la Ley de Bienestar Animal. Según lo exige el Departamento de Defensa de los EE. UU., el programa de cuidado y uso de animales del MMP es revisado de forma rutinaria por un Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y por la Oficina de Medicina y Cirugía de la Marina de los EE. UU. El protocolo de uso y cuidado de animales para los delfines del MMP en apoyo de este estudio fue aprobado por la IACUC del MMP y la Oficina de Medicina y Cirugía de la Marina (IACUC #92-2010, BUMED NRD-681).

Para separar las células de los hisopos, los hisopos se sumergieron en 1X PBS (~50–100 µL, dependiendo de la densidad celular) en tubos de microcentrífuga. Los tubos se agitaron vigorosamente durante ~ 10 s y se centrifugaron ligeramente para eliminar el líquido de las tapas de los tubos. La solución resultante se usó para microscopía.

Se colocó aproximadamente 1 µl de solución celular en PBS en una almohadilla de agarosa (1 % de agarosa en PBS) y se tomaron imágenes con un microscopio invertido Eclipse Ti-E con un objetivo 100X (NA: 1,4) (Nikon, Tokio, Japón). Para determinar la localización del ADN, las células se tiñeron con DAPI a una concentración final de 0,5 μg mL−1 durante 5 min antes de la obtención de imágenes utilizando espectros de emisión/excitación de 340/488 nm. Se lograron imágenes automatizadas de alto rendimiento de muestras orales de delfines a través de microscopía de contraste de fase utilizando el Strain Library Imaging Protocol38 para capturar 226 campos de visión para cada una de las muestras recolectadas en 2018 y 100 campos de visión para las recolectadas en 2022.

La tinción de Gram se realizó utilizando un kit de tinción de Gram (Sigma Aldrich, nº de cat. 77730-1KT-F) siguiendo el protocolo del fabricante. Se tomaron imágenes de las células usando un microscopio de campo claro con un objetivo 100X (Nikon). Se aplicó colorante FM4-64 (ThermoFisher Scientific, nº de cat. T13320) directamente a las muestras de torunda oral de delfines siguiendo el protocolo del fabricante. El colorante FM4-64 no tiñó ninguna parte de los RBS.

Se aplicó una solución de celdas en PBS (2,5 µl) a rejillas Quantifoil de carbón perforado y cobre de malla 200 con descarga luminiscente (Quantifoil, Großlöbichau, Alemania, Cat. n.° Q2100CR1) o rejillas Quantifoil GridFinder de oro (Quantifoil, Großlöbichau, Alemania, Cat. n.° LFH2100AR2), seguido de la aplicación de 2 µL de solución fiduciaria de oro de 15 nm en ambos lados de cada rejilla. Las rejillas se secaron durante 5 s y se congelaron por inmersión en etano líquido enfriado con nitrógeno líquido a aproximadamente -195 ° C utilizando un congelador de inmersión EM GP (Leica, Wetzlar, Alemania).

Las muestras se cargaron en uno de dos microscopios: un Titan Krios G3 operado a 300 kV con un filtro de energía (ancho de rendija de 20 eV), o un Titan Krios G4 operado a 300 kV sin filtro de energía. Ambos microscopios estaban equipados con un dispositivo de detección directa de electrones K2 Summit (Gatan, Pleasanton, EE. UU.) utilizado para registrar micrografías. Los datos se adquirieron de forma semiautomática en modo de conteo utilizando SerialEM (v. 3.8)61. Los parámetros de imágenes de CryoEM/ET se proporcionan en la Tabla complementaria 6.

Los montajes se combinaron y agruparon 4 veces o más usando el algoritmo "blendmont"62 de IMOD v. 4.12.9 y se normalizaron, se filtraron con paso de banda, se rotaron y se recortaron con fines de visualización usando EMAN2 v. 2.3963. Quince de las dieciséis series de inclinación eran adecuadas para la reconstrucción tomográfica en IMOD v. 4.12.9. Las series de inclinación con muestreo a 7,5 Å píxel-1 se muestrearon a la baja dos veces y aquellas con muestreo a 3,48 o 3,75 Å píxel-1 se muestrearon a la baja 4 veces. Las imágenes con artefactos como carga excesiva, deriva, gran contaminación de hielo arrastrándose con inclinaciones altas o grosor excesivo con inclinaciones altas se excluyeron de 12 de la serie de inclinaciones antes de la alineación manual basada en referencias de oro; Se eliminaron hasta 13 imágenes de las 41 imágenes de la serie de inclinación sin procesar original.

Los tomogramas se reconstruyeron utilizando retroproyección ponderada estándar y un filtro similar a SIRT (que imita 16 iteraciones) y se filtraron con paso de banda y se dividieron en 2 veces en la mayoría de los casos para la anotación de características, la segmentación, la producción de películas y otros fines de visualización. . El grosor del tomograma se estimó identificando visualmente los cortes z más pequeños y más grandes con RBS-A visible o densidades de contaminación por hielo y convirtiendo el número de cortes a nanómetros. Se intentó promediar el subtomograma utilizando EMAN2 v. 2.3964,65 para las densidades globulares sospechosas de ser ribosomas, las densidades de la matriz debajo de la membrana externa, los parches de la cubierta periódica de la superficie y las regiones de los apéndices tipo pilus, pero no hubo estructuras interpretables con una resolución mejor que ~ Se obtuvieron 50 Å. Los rangos de grosor y longitud de los apéndices similares a pilus se derivaron escaneando visualmente los cortes en los tomogramas en busca de los filamentos individuales más delgados y los haces más gruesos perceptibles a simple vista y midiendo sus dimensiones en cortes tomográficos agrupados por 4 utilizando la medición herramienta de cinta de EMAN2 e2display.py. La distancia repetida de la cobertura periódica de la superficie se midió manualmente de manera similar a los apéndices similares a pilus de los cortes tomográficos, con ~10–20 mediciones de cada uno de los tres tomogramas que mostraban al menos pequeñas regiones donde la repetición era perceptible. Esta cuantificación arrojó un rango entre ~6 y 10 nm, lo que sugiere que los componentes de la capa son flexibles o que la estructura subyacente puede generar diferentes distancias aparentes entre sus subunidades según el ángulo en el que se corte. Además, las regiones que mostraban el patrón mucho más claramente en imágenes de proyección bidimensional de montaje de mayor aumento se recortaron, se giraron para que quedaran en un plano horizontal, se filtraron y se enmascararon para calcular perfiles de densidad de línea paralelos a la membrana exterior.

Inicialmente, llevamos a cabo anotaciones tomográficas de tres características (recubrimiento superficial periódico, membranas lipídicas y apéndices similares a pilus) para tres tomogramas utilizando la canalización basada en redes neuronales bidimensionales semiautomáticas de EMAN266 y realizamos una limpieza manual de falsos positivos en UCSF Quimera v. 1.1667. Los mapas de probabilidad de anotación de salida de EMAN2 v. 2.39 se convirtieron en segmentaciones aplicando un umbral determinado visualmente y multiplicando los tomogramas de contraste invertido por el mapa de anotación con umbral. Las segmentaciones se filtraron en paso bajo con EMAN2 v. 2.39 para suavizar el ruido. Sin embargo, dado que la complejidad de las estructuras subcelulares no fue capturada por las anotaciones semiautomáticas, aplicamos un proceso similar para generar segmentaciones de cinco características (apéndices similares a pilus, cubierta de superficie periódica, membrana externa, matriz y membranas internas) usando manual anotaciones realizadas con IMOD v. 4.12.9, siguiendo un protocolo reciente que aumenta la eficiencia de la anotación manual68. Las instantáneas de la Fig. 6 que muestran las características de RBS-A en color, así como las Películas complementarias 2 y 3 que muestran los resultados de la segmentación, se produjeron con UCSF Chimera v. 1.16.

Primero identificamos una cuadrícula que contenía RBS-As usando microscopía óptica. Utilizando un Aquilous CryoFIB (ThermoFisher Scientific, MA, EE. UU.), creamos cinco láminas utilizando 30 kV, 30 pA de corriente y 5 µs de tiempo de duración. Luego, las muestras se cargaron en un cryoTEM para la observación de muestras y la recopilación de datos. No pudimos identificar RBS en las laminillas.

Se prepararon cultivos celulares de Escherichia coli MG1655 axénico, Skeletonema costatum LB 2308 no axénico (UTEX Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin, Austin, TX, EE. UU.), Caulobacter crescentus CB15N y Simonsiella muelleri ATCC 29453 como controles. E. coli se cultivó en caldo LB y se cultivó a 37 °C, S. costatum se cultivó en medio de Erdschreiber a 20 °C con un ciclo de ~12 h de luz y ~12 h de oscuridad, C. crescentus se cultivó en medio PYE a 30 °C, y S. muelleri se cultivó en medio BSTSY (2,75 % (p/v) de caldo de soja tríptica, 0,4 % (p/v) de extracto de levadura, 10 % de suero bovino) a 37 °C.

Todas las sondas FISH se solicitaron a Integrated DNA Technologies (Coralville, EE. UU.) con purificación por HPLC. Las secuencias de sonda y las etiquetas de fluorescencia son las siguientes: Euk-1209: 5'-GGGCATCACAGACCTG-/3Alx660/−3', Bact338: 5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-/Alx488/−3', BET42a: 5'-/Alx594/-GCCTTCCCACTTCGTTT- 3', GAM42a: 5'-/Alx488/-GCCTTCCCACATCGTTT-3', no EUB: 5'-/Cy5/-ACTCCTACGGGAGGCAGC-3'.

Las células de los controles y RBS-A se recogieron en tubos de microcentrífuga. Para garantizar una biomasa suficiente de los hisopos orales de delfines, las células de cuatro hisopos se condensaron en un solo tubo. El protocolo FISH se adaptó de la ref. 69. Las células se fijaron en 1 mL de solución de formaldehído al 3,7 % (800 μL de agua tratada con DEPC, 100 μL de PBS 10X, 100 μL de formaldehído al 37 %) durante 30 min con agitación suave a 700 rpm. A continuación, las células se lavaron dos veces en 1 ml de PBS 1X y se permeabilizaron en una mezcla de 300 μl de agua tratada con DEPC y 700 μl de etanol de 200 pruebas con agitación suave a 700 rpm durante 2 h. Las sondas se agregaron a 50 μL de solución de hibridación hasta una concentración final de 1 μM por conjunto de sondas. Para BET42a y GAM42a, la solución de hibridación contenía una solución de formamida al 55 % (4 ml de agua DEPC, 1 g de sulfato de dextrano, 4,85 ml de formamida, 1 ml de 2X SSC, llevado a un volumen total de 10 ml con agua tratada con DEPC). agua); para otras sondas, la solución de hibridación contenía formamida al 40 % (5 ml de agua DEPC, 1 g de sulfato de dextrano, 3,53 ml de formamida, 1 ml de 2X SSC, llevado a un volumen total de 10 ml con agua tratada con DEPC) . Para BET42a y GAM42a, las células se incubaron en 50 µL de tampón de hibridación con sondas a 46 °C durante 1 h; para otras sondas, las células se incubaron durante la noche en 50 µl de tampón de hibridación con sondas FISH a 30 °C. Las células se lavaron dos veces con una solución de lavado (2 ml de tampón SSC 20X, 7,06 ml de formamida, 10,94 ml de agua tratada con DEPC) y se resuspendieron en tampón SSC 2X. Se montó un microlitro de células en almohadillas de agarosa al 1% que contenían PBS y 5 µg mL-1 de DAPI para obtener imágenes. Los datos de imágenes se procesaron utilizando FIJI v. 2.0.070.

Cincuenta y cuatro muestras orales de delfines fueron seleccionadas para la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA. El ADN genómico se extrajo de muestras orales de delfines y 32 controles negativos (PBS) utilizando el kit microbiano DNeasy UltraClean 96 (Qiagen Cat. #10196-4) siguiendo las instrucciones del fabricante. La región 16S rRNA V4 se amplificó usando cebadores 515F y 806rB usando Platinum™ II HotStart PCR Master Mix (ThermoFisher Cat. #14000013). Los productos de la PCR se agruparon en volúmenes iguales y se purificaron en gel. La purificación final se realizó utilizando Macherey-Nagel NucleoSpin Gel y PCR Clean-up, Mini Kit (Fisher, Cat. #740609). Los amplicones se secuenciaron en la plataforma Illumina MiSeq con lecturas emparejadas de 250 pb en Stanford Chan Zuckerberg Biohub Facility, lo que resultó en una profundidad de lectura media de 92 077 lecturas (mín.: 50 772, máx.: 265 108).

La demultiplexación se realizó utilizando Bcl2Fastq v. 2 (Illumina, CA, EE. UU.). Los ASV se infirieron utilizando DADA271 v. 1.16.0, siguiendo las pautas del "Flujo de trabajo de Big Data" (https://benjjneb.github.io/dada2/bigdata_paired.html). Las afiliaciones taxonómicas se asignaron utilizando como referencia la base de datos SILVA 138 SSU72. Las lecturas directas e inversas se recortaron a 240 y 180 nt, respectivamente. Esta canalización produjo un total de 1116 taxones y 5 339 751 lecturas en las 54 muestras. Los ASV se analizaron utilizando phyloseq v. 1.28.072.

Para confirmar que nuestra tubería de extracción, amplificación, secuenciación y análisis bioinformático de ADN pudo identificar miembros de la familia Neisseriaceae, realizamos un experimento de refuerzo. Primero seleccionamos una muestra oral de delfín que contenía RBS-As, según lo determinado por microscopía de contraste de fase. Luego creamos dos alícuotas de esta muestra. A la primera alícuota, le agregamos células de un cultivo puro de S. muelleri en una proporción de 1:1. La otra alícuota se dejó intacta. Estas dos muestras, junto con una alícuota del cultivo puro de S. muelleri (control positivo), se sometieron a extracción de ADN, amplificación por PCR y protocolo de secuenciación como se describe anteriormente. Las tres muestras se secuenciaron en una sola ejecución de Illumina MiSeq, que no estaba en el mismo carril que las otras muestras de amplicón de este estudio. Tenga en cuenta que al amplificar S. muelleri por PCR en el mismo entorno de laboratorio que la muestra de control negativo y luego secuenciarla en el mismo carril, es de esperar cierta contaminación cruzada. La primera vez que se secuenció la muestra de control negativo (en ausencia de cultivos puros de S. muelleri en el laboratorio), no se detectaron amplicones de la familia Neisseriaceae.

Para obtener identidades candidatas para RBS-As, empleamos un enfoque de minimetagenómica. Para limitar la contaminación por ADN extraño, los reactivos, los tubos y el PBS se trataron con 11,4 J cm−2 de luz ultravioleta siguiendo las pautas de la ref. 72. Los RBS-A se visualizaron utilizando un microscopio invertido Olympus IX70 (Olympus, Waltham, EE. UU.) con un objetivo de 40X y óptica de modulación Hoffman. Se utilizó un micromanipulador Eppendorf TransferMan (Eppendorf, Hamburgo, Alemania, Cat. #5193000020) con un microinyector SAS-10 para capturar RBS-As con micropipetas de biopsia de cuerpo polar (en ángulo de 30°, biseladas y pulidas con un diámetro interior de 13– 15 μm) (Cooper Surgical, Målov, Dinamarca, Cat. #MPB-BP-30). Después de adquirir un RBS-A o una cadena de RBS-As, la punta de la micropipeta se transfirió a un tubo de recolección que contenía PBS 1X y se aplastó en el tubo para garantizar que los RBS-A se depositaran en el tubo; se adoptó esta precaución porque RBS-As se pegaba con frecuencia a la micropipeta de vidrio y no se podía desalojar. No se capturaron células de delfín, aunque es probable que el ADN libre de células y las células pequeñas no objetivo de la muestra se adquirieran como contaminantes junto con RBS-A en función de la propensión de este último a adherirse a otras especies (Fig. 5e). Se recolectaron cuatro tubos de RBS-As (nombres de muestra RBS1-4), junto con cuatro tubos de control negativo (NEG1-4). Los controles negativos consistieron en extracciones de PBS de la misma muestra que no contenía células visibles y, por lo demás, se trataron de forma idéntica a las muestras que contenían RBS-A.

El ADN de cada tubo se amplificó mediante MDA utilizando el kit de células individuales Repli-g (Qiagen, Hilden, Alemania, Cat. n.° 150343) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN se purificó utilizando una columna de centrifugación Zymo Clean and Concentrate (Zymo Research Corporation, Irvine, EE. WM Keck Center for Comparative Functional Genomics de la Universidad de Illinois, Urbana-Champaign. Las ocho bibliotecas se secuenciaron utilizando la plataforma Illumina MiSeq 2 × 250 nt P2 V2. Las muestras RBS-A RBS1, RBS2, NEG1 y NEG2 se agruparon y secuenciaron en un solo carril que produjo 11 371 243 pares de lectura, y las muestras RBS3, RBS4, NEG3 y NEG4 se agruparon y secuenciaron en 1,5 carriles, lo que produjo en conjunto 19 615 690 pares de lectura. Los adaptadores de secuenciación se eliminaron computacionalmente en el Keck Center.

Las lecturas de las ocho muestras se coensamblaron utilizando SPAdes v. 3.11.173 con los modos de celda única (–sc) y cuidadoso (–cuidadoso) especificados. Se utilizó un total de 61 973 866 pares de lectura para el ensamblaje, lo que resultó en 1406 andamios de ≥5 kpb de largo con una longitud total de 17 438 233 pb y un N50 de 14 592 para andamios de ≥5 kpb de largo. Los genes que codifican proteínas se identificaron utilizando Prodigal v. 2.6.274. La cobertura promedio por andamio se calculó mapeando lecturas por muestra contra el coensamblaje usando bowtie2 v. 2.2.475, usando la función de profundidad samtools v. 1.676 para calcular la cobertura de lectura por base, y un script personalizado para calcular el promedio por base Cobertura de lectura por andamio.

Se realizó una búsqueda del gen amiC2 en contenedores recuperados del experimento de mini-metagenómica consultando la alineación de Pfam PF01520 contra las secuencias de proteínas de cada genoma, utilizando la suite HMMER v. 3.1b277.

Para determinar la identidad taxonómica de las células secuenciadas, empleamos un enfoque resuelto por el genoma. La asignación de andamios a los contenedores del genoma se realizó utilizando las frecuencias de tetranucleótidos de todos los andamios de ≥5 kbp de largo en ventanas de 5 kbp, como se describe en la ref. 78. Los resultados se calcularon y visualizaron utilizando el software Databionics ESOM Tools v. 1.179, lo que condujo a la reconstrucción de 18 contenedores de genoma (Fig. 3 complementaria). Para refinar los contenedores, eliminamos los scaffolds para los cuales se asignaba menos del 50 % de las claves al contenedor. Los andamios <5 kbp de largo no se agruparon. La integridad y la contaminación por contenedor se evaluaron utilizando CheckM v. 1.0.780. Para evaluar qué tan representativo fue el agrupamiento de los genomas que se secuenciaron, estimamos la cantidad de genomas procarióticos que se esperaba recuperar buscando en el ensamblaje del metagenoma un conjunto de 16 genes bacterianos de copia única (bSCG) que se supone que están presentes en cada genoma en una sola copia81, a saber, las proteínas ribosómicas L2, L3, L4, L5, L6, L14, L15, L16, L18, L22, L24, S3, S8, S10, S17 y S19. Alineaciones para estas proteínas (PF00181, PF00297, PF00573, PF00281, PF00347, PF00238, PF00828, PF00252, PF00861, PF00237, PF17136, PF00189, PF00410, PF00338, PF00 366 y PF00203) se obtuvieron de la base de datos de Pfam82 (consultado en marzo de 2019) y consultado contra nuestro conjunto de datos utilizando HMMER suite v. 3.1b277. El número medio de cada bSCG fue 10, lo que sugiere que en nuestro conjunto de datos de secuenciación se representaron ~ 10 genomas procarióticos. En el caso del genoma de interés de la familia Alcaligenaceae, el gen 16S rRNA se extendió manualmente desde el final de un andamio; usando bowtie2 v. 2.2.4 nos aseguramos de que las lecturas fueran compatibles con la secuencia final.

La identificación taxonómica de los contenedores planteó un desafío ya que los genes 16S/18S rRNA no se amplificaron, secuenciaron ni ensamblaron de manera confiable, y los genomas fueron parciales con pocos bSCG filogenéticamente informativos presentes en el conjunto de datos. Por lo tanto, usamos BLAST v. 2.2.3083 para consultar todos los genes que codifican proteínas de cada genoma contra la base de datos de proteínas no redundantes del NCBI usando un valor e de 10−10 y las asignaciones taxonómicas se realizaron en función de la proteína más cercana. Las asignaciones taxonómicas del bin del genoma se consideraron muy probables si ≥50 % de los principales aciertos de BLAST se originaron en un solo taxón y se consideraron plausibles si <50 % pero ≥33 % de los principales aciertos de BLAST se originaron en un solo taxón.

Existen numerosos enfoques mediante los cuales se podría evaluar si un contenedor está "presente" en una muestra, cada uno con umbrales en gran medida arbitrarios. Nos enfocamos en la abundancia relativa de cada contenedor por muestra (Tabla complementaria 4), ya que representa la longitud de cada contenedor y permite comparaciones entre muestras con diferentes números de pares de lectura16.

Las filogenias de máxima probabilidad de la familia Alcaligenaceae se infirieron utilizando el gen 16S rRNA (Fig. 4a complementaria) y la proteína ribosómica S3 (Fig. 4b complementaria) para confirmar la afiliación taxonómica del bin 16, que se recuperó del experimento de minimetagenómica. Se adquirieron secuencias de genes/proteínas para cada género caracterizado en la familia Alcaligenaceae, como se muestra en el Navegador de taxonomías del NCBI (consultado en agosto de 2022), cuando dichas secuencias estaban disponibles en el sistema del NCBI (algunos géneros tienen escasa o ninguna representación genómica). Además, realizamos consultas BLAST83 v. 2.2.30 del gen bin 16 16S rRNA y la proteína rpS3 contra las bases de datos nr/nt y nr (consultadas en agosto de 2022), respectivamente, e incluimos las 10 secuencias más similares. Las secuencias del gen 16S rRNA se alinearon usando SINA84 v. 1.2.11, usando la versión 138.1 de la base de datos SILVA SSU como referencia, y se eliminaron las columnas que contenían > 3 % de espacios o filas con < 50 % de secuencia. Las secuencias de la proteína rpS3 se alinearon utilizando Clustal Omega85,86 v. 1.2.4 y se eliminaron las columnas que contenían > 5 % de espacios o filas con < 50 % de secuencia. Ambas filogenias se infirieron utilizando PhyML87 v. 3.1 con 1000 réplicas de arranque, y la selección del modelo se realizó mediante la selección del modelo inteligente88 (GTR+R para el gen 16S rRNA y Q.yeast+G+I para la proteína rpS3). Los árboles se visualizaron utilizando iTOL89 v. 6.

Se seleccionaron cuatro muestras orales de delfines que se confirmó que contenían RBS para los esfuerzos de cultivo. Para cada muestra, se añadió un mililitro de PBS estéril a un tubo Eppendorf de 1,5 ml que contenía la muestra de hisopo oral. Para el cultivo líquido, se utilizaron 600 µl de cada muestra para inocular 3 ml de BSTSY90 (2,75 % (p/v) de caldo de soja tríptico, 0,4 % (p/v) de extracto de levadura, 10 % de suero bovino), SHI91 o medio mSHI (SHI suplementado con 0,9 g/L de NaCl, 2,5 g/L de K2PO4, 0,84 g/L de NaHCO3, 0,17 g/L de CaCl2, 0,04 g/L de MgCl2•6H2O y 5 g/L de dextrosa). BSTSY fue seleccionado por su uso en el cultivo exitoso de bacterias (específicamente S. muelleri) de las cavidades orales de varios mamíferos90. SHI fue seleccionado porque este medio fue diseñado para sostener comunidades de alta diversidad derivadas de la microflora oral humana. mSHI (SHI modificado) se incluyó como una versión de mayor salinidad de SHI en un intento de imitar aún más las condiciones que podrían encontrarse en la cavidad bucal de los delfines. La inoculación se repitió en condiciones anaeróbicas en una cámara anaeróbica (COY Lab Products, Grass Lake, EE. UU.); tenga en cuenta que todas las muestras estuvieron inevitablemente expuestas al oxígeno atmosférico antes del cultivo. Los cultivos se incubaron a 37 °C para imitar la temperatura corporal de los delfines. No se detectaron RBS en medios líquidos mediante examen visual bajo un microscopio después de ~ 24, ~ 48, ~ 72 y ~ 96 h. Para el cultivo de superficie sólida, ~103-104 células (verificadas por microscopía que contienen RBS-As) se sembraron directamente en placas de agar BSTSY o BHI-sangre (medio BHI suplementado con sangre de oveja al 5 %) y se incubaron a 37 °C con o sin oxígeno, respectivamente. No crecieron colonias en las placas BSTSY después de 3 semanas de incubación; las colonias cultivadas en las placas de sangre BHI se rastrearon usando microscopía y no se observaron RBS. Por el contrario, un control de S. muelleri sembrado en placas BSTSY desarrolló colonias visibles después de 1 a 2 días de incubación con oxígeno a 37 °C, y se verificó bajo microscopía que las colonias consistían en células con la morfología esperada de S. muelleri.

Dada la naturaleza exploratoria de este estudio descriptivo, la mayoría de los experimentos para caracterizar los RBS se realizaron en una sola vez.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación para este proyecto están disponibles a través de NCBI BioProject PRJNA174530. Las lecturas sin procesar para la encuesta de amplicón se depositaron en SRA y están asociadas con BioSamples SAMN32739817-69 y SAMN19012476. Los datos del experimento adicional están asociados con BioSamples SAMN32869723-5. Las lecturas sin procesar para el experimento de genómica de una sola célula también se depositaron en SRA; los RBS capturados y los controles negativos se derivaron físicamente de un solo hisopo oral representado por BioSample SAMN19012476, mientras que las lecturas de las ocho réplicas experimentales (cuatro RBS, cuatro controles negativos) están asociadas individualmente con BioSamples SAMN19022663-SAMN19022670. El ensamblaje conjunto de andamios de ≥5 kb de longitud del experimento de genómica unicelular se depositó como un proyecto de escopeta de genoma completo en DDBJ/ENA/GenBank con el registro JAHCSF000000000, luego de la eliminación de secuencias derivadas de humanos. La versión descrita en este documento es JAHCSF010000000. Los contenedores de genoma 2–5 y 7–18 del experimento de genómica unicelular se han depositado como un proyecto de escopeta de genoma completo en DDBJ/ENA/GenBank con las entradas JAGYHI000000000-JAGYHX000000000. Las versiones descritas en este documento son JAGYHI010000000-JAGYHX010000000. El contenedor del genoma 1 (humano) no se depositó. Los andamios para el genoma bin6 (<100 000 nucleótidos) se depositaron como un envío GenBank que no es del genoma con los números de acceso MZ126582-MZ126593. Los conjuntos de datos públicos y las bases de datos utilizados en este estudio son los siguientes: la versión 138.1 de la base de datos SILVA SSU se utilizó como referencia para asignar identidades taxonómicas a los ASV. Las bases de datos NCBI nr/nt, nr y taxonomía (consultadas en agosto de 2022) se utilizaron para obtener secuencias del gen 16S rRNA (n = 77) y secuencias de la proteína ribosomal S3 (n = 63) para representantes de géneros de la familia Alcaligenaceae. Los números de acceso de NCBI para estas secuencias están disponibles en las Figs. complementarias. 4 y 5, respectivamente. Finalmente, realizamos análisis con alineaciones provenientes de la base de datos Pfam82. Se utilizó la alineación de Pfam PF01520 para buscar en los contenedores del genoma las proteínas AmiC2 (consultado en agosto de 2022). Se usaron las siguientes alineaciones de Pfam para buscar 16 genes bacterianos de copia única (consultados en marzo de 2019): PF00181, PF00297, PF00573, PF00281, PF00347, PF00238, PF00828, PF00252, PF00861, PF00237, PF17136, PF001 89, PF00410, PF00338, PF00366 y PF00203.

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Descargar referencias

Agradecemos a los miembros del laboratorio de Relman por los debates perspicaces, a Katharine Ng y Brian Yu por su asistencia en los intentos de capturar RBS-A utilizando microdisección de captura láser y microfluidos, respectivamente, a Melissa Clark por su asistencia con la tinción de Gram, a Michael Schmid por el análisis de la superficie periódica cubriendo RBS-As, y especialmente Celeste Parry y sus colegas en el Programa de Mamíferos Marinos de la Marina de los EE. UU. en San Diego, CA por recolectar muestras orales de delfines. Este trabajo fue apoyado por la subvención P41GM103832 (WC) de los NIH, una beca postdoctoral James S. McDonnell (HS), el Fondo de Ciencias de Austria (TV, SB) y la Fundación Thomas C. y Joan M. Merigan en la Universidad de Stanford (DAR) . KCH y DAR son investigadores de Chan Zuckerberg Biohub.

Natasha K. Dudek

Dirección actual: Quantori, Cambridge, MA, 02142, EE. UU.

megan mayer

Dirección actual: Departamento de Química Biológica y Farmacología Molecular, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, 02115, EE. UU.

Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, 94305, EE. UU.

Natasha K. Dudek y David A. Relman

Departamento de Ecología y Biología Evolutiva, Universidad de California, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, EE. UU.

Natasha K. Dudek

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Stanford, Stanford, CA, 94305, EE. UU.

Jesús G. Galaz-Montoya, Handuo Shi, Cristina Danita, Gong-Her Wu, Kerwyn Casey Huang y Wah Chiu

Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, 94305, EE. UU.

Handuo Shi, Arianna I. Celis, Kerwyn Casey Huang, Wah Chiu y David A. Relman

División de CryoEM y Bioimaging, SSRL, SLAC National Accelerator Laboratory, Menlo Park, CA, 94025, EE. UU.

Megan Mayer y Wah Chiu

Departamento de Ecología Funcional y Evolutiva, Grupo de Biología Celular Ambiental, Universidad de Viena, Viena, Austria

Tobias Viehboeck y Silvia Bulgheresi

División de Ecología Microbiana, Centro de Microbiología y Ciencias de Sistemas Ambientales, y Escuela de Doctorado en Ecología y Evolución de Viena, Universidad de Viena, Viena, Austria

Tobias Viehboeck

Departamento de Obstetricia y Ginecología, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, 94305, EE. UU.

barry behr

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, California, 94158, EE. UU.

Kerwyn Casey Huang y David A. Relman

Sección de Enfermedades Infecciosas, Asuntos de Veteranos Sistema de Atención Médica de Palo Alto, Palo Alto, CA, 94304, EE. UU.

David A. Relman

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Conceptualización: NKD, KCH, DAR Metodología e investigación: NKD, JGG-M., HS, MM, CD, AIC, G.-HW, TV, SB, BB, KCH, WC, DAR Análisis formal: NKD, JGG-M ., HS, CD Visualización: NKD, JGG-M., HS, CD Escritura—borrador original: el manuscrito fue escrito principalmente por NKD y JGG-M. basado en el borrador original de NKD, con revisiones de todos los demás autores. Redacción—revisión y edición: todos los autores. Supervisión: KCH, WC, DAR

Correspondencia a David A. Relman.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Brian Hedlund y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Dudek, NK, Galaz-Montoya, JG, Shi, H. et al. Estructuras bacterianas rectangulares previamente no caracterizadas en la boca del delfín. Nat Comun 14, 2098 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37638-y

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Recibido: 01 noviembre 2021

Aceptado: 23 de marzo de 2023

Publicado: 13 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37638-y

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