Análisis estructural y funcional de la proteína Ecm16 que confiere resistencia a la equinomicina de Streptomyces lasalocidi - Grupo Co., Ltd de los laboratorios de minería de Foshan

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7980 (2023) Citar este artículo

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La equinomicina es un producto natural antibiótico bisintercalador de ADN. El grupo de genes biosintéticos de equinomicina en Streptomyces lasalocidi incluye un gen que codifica la proteína de autorresistencia Ecm16. Aquí presentamos la estructura cristalina de resolución de 2,0 Å de Ecm16 unida a difosfato de adenosina. La estructura de Ecm16 se parece mucho a la de UvrA, el componente sensor de daños en el ADN del sistema de reparación por escisión de nucleótidos procarióticos, pero Ecm16 carece del dominio de unión de UvrB y su módulo de unión de zinc asociado que se encuentra en UvrA. El estudio de mutagénesis reveló que se requiere el dominio de inserción de Ecm16 para la unión al ADN. Además, la secuencia de aminoácidos específica del dominio de inserción permite que Ecm16 distinga el ADN unido a equinomicina del ADN normal y vincule la unión del sustrato a la actividad de hidrólisis de ATP. La expresión de ecm16 en el huésped heterólogo Brevibacillus choshinensis confirió resistencia contra la equinomicina y otros antibióticos de quinomicina, incluidos la tiocoralina, la quinaldopeptina y la sandramicina. Nuestro estudio proporciona nuevos conocimientos sobre cómo los productores de antibióticos bisintercaladores de ADN se defienden de los compuestos tóxicos que producen.

Los antibióticos de quinomicina actúan mediante la unión no covalente a la doble hélice del ADN1. Son bisintercaladores de ADN, compuestos que se unen de forma reversible al dúplex de ADN mediante la inserción de un par de grupos de anillos aromáticos entre pares de bases adyacentes del ADN. Ha habido mucho interés en esta familia de compuestos debido a su potente actividad antimicrobiana y antitumoral, que culminó en un gran cuerpo de conocimiento bioquímico, estructural y clínico2. Sin embargo, los detalles mecánicos sobre la resistencia bacteriana contra los bisintercaladores de ADN siguen siendo limitados. Si bien hasta el momento no se ha descubierto ningún elemento de resistencia contra estos compuestos en bacterias patógenas, es prudente identificar y dilucidar los mecanismos de resistencia que están presentes en el entorno natural. El conocimiento de los mecanismos básicos de resistencia permitirá a los investigadores desarrollar nuevas estrategias terapéuticas antes de que la resistencia a la quinomicina se convierta en un problema clínico.

Los productores de antibióticos de quinomicina suelen contener uno o más genes de autorresistencia, que se encuentran dentro del grupo de genes biosintéticos de antibióticos o en otra parte del genoma. Por ejemplo, la bacteria productora de triostina contiene un gen que codifica para un transportador ABC3, y la productora de tiocoralina contiene genes que codifican para un transportador ABC así como una proteína secuestradora de tiocoralina4,5. Curiosamente, los productores de quinomicina también contienen un gen para un UvrA -proteína similar en su grupo de genes biosintéticos (Tabla 1). UvrA es una enzima reparadora del ADN de la vía universal de reparación por escisión de nucleótidos procarióticos (NER). Brevemente, UvrA reconoce el daño en el ADN y recluta UvrB en el sitio de la lesión. UvrB recluta a UvrC, que escinde el enlace fosfodiéster ocho nucleótidos aguas arriba y hasta cinco nucleótidos aguas abajo del nucleótido modificado. A continuación, UvrC recluta la helicasa UvrD que desplaza el fragmento de ADN cortado. La ADN polimerasa I sintetiza el tramo faltante de ADN utilizando la cadena complementaria no dañada como plantilla y la ADN ligasa sella las roturas, completando así la reparación6.

La equinomicina es un bisintercalador de ADN prototípico producido por múltiples actinomicetos, incluidos Streptomyces echinatus y Streptomyces lasalocidi (anteriormente conocido como S. lasaliensis)7,8,9. Es un depsipéptido cíclico que contiene dos grupos quinoxalina y un puente tioacetal inusual (fig. 3)10. La equinomicina muestra una potente actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus resistente a la meticilina y enterococos resistentes a la vancomicina11,12, pero no se usa clínicamente debido a problemas de solubilidad y toxicidad. El grupo de genes biosintéticos de equinomicina de S. lasalocidi contiene genes que codifican enzimas que sintetizan el grupo quinoxalina, enzimas que construyen el esqueleto peptídico y genes que codifican proteínas con función desconocida13. Una de las proteínas funcionalmente no caracterizadas es Ecm16, que se postuló para brindar autoprotección contra la equinomicina en función de la identidad de secuencia (~ 30 %) que comparte con las proteínas procarióticas UvrA que funcionan en la vía NER13.

Anteriormente informamos sobre la caracterización funcional in vivo e in vitro de Ecm1614. Los principales hallazgos de ese estudio son (1) la Escherichia coli K12 sensible a la equinomicina se vuelve resistente a la equinomicina tras la transformación con el plásmido codificante ecm16, (2) Ecm16 no requiere la participación de las proteínas NER UvrA, UvrB, UvrC o UvrD para proporcionar equinomicina resistencia, (3) Ecm16 no complementa la función de UvrA, (4) la actividad ATPasa de Ecm16 es esencial para su actividad anti-equinomicina, (5) Ecm16 se une al ADN de doble cadena de manera independiente a la secuencia de nucleótidos, y (6) Ecm16 se une al ADN que contiene equinomicina ~ dos veces más fuerte que al ADN libre de equinomicina. En el estudio actual, hemos determinado la estructura cristalina de Ecm16 para proporcionar un contexto estructural a su función. También hemos realizado estudios mutacionales para diseccionar el papel del dominio de inserción de Ecm16. En las proteínas UvrA, el dominio de inserción está implicado en la unión al ADN específica del daño15. Por último, hemos probado la especificidad de sustrato de Ecm16 desafiando las células que expresan ecm16 con una serie de antibióticos dirigidos al ADN con quinomicina y sin quinomicina.

Hemos determinado la estructura de Ecm16 unida al difosfato de adenosina (ADP) a una resolución de 2,0 Å (Fig. 1a). Nuestro modelo final consta del homodímero Ecm16, cuatro ADP, dos Mg2+, cuatro Zn2+ y 612 moléculas de agua (Tabla 2). Algunos residuos, incluidos 183-293 de la cadena A y 185-295 de la cadena B que incluye todo el dominio de inserción, no se modelaron debido a la falta de densidad de electrones (Tabla complementaria 1). Cada protómero de Ecm16 contiene dos motivos ABC ATPasa, denominados dominios de unión a nucleótidos I y II (NBD-I y NBD-II). NBD-I consta del dominio I de unión a ATP, el dominio de firma I y el dominio de inserción. El dominio de inserción no era visible en la estructura cristalina, presumiblemente porque está desordenado. NBD-II consta del dominio II de unión a ATP y el dominio de firma II. A NBD-II le falta la cadena de giro de hélice que corresponde al residuo 66-99 de NBD-I (Fig. 1 complementaria). Aparte de estas dos diferencias, NBD-I y NBD-II tienen una estructura general relativamente similar (RMSD = 1,5 Å para 208 átomos de Cα). La interfaz de dímero de Ecm16 entierra ~ 3900 Å2 de área superficial y está compuesta por residuos de los dominios de unión a ATP I, firma I y firma II (Fig. 2 complementaria). El lado ventral de Ecm16 presenta un surco extendido que está revestido con numerosos residuos básicos (K136, K143, K381, R384, R567, K568, R537, K549, K572, K577) (Fig. 3 complementaria). Este surco de ~ 10 nm de largo y ~ 2 nm de ancho puede alojar potencialmente un ADN en forma de B de ~ 32 pb y proporciona una base estructural para la actividad de unión al ADN de Ecm1614 informada anteriormente.

Estructura cristalina de Ecm16. ( a ) Organización del dominio y estructura general del homodímero Ecm16. El dominio de inserción está presente en la estructura primaria, pero no se observa en la estructura cristalina. Los átomos de ADP, Zn2+ y Mg2+ se dibujan como esferas (C: amarillo, N: azul, O: rojo, P: naranja, Zn: gris, Mg: verde). (b) Sitio de unión de nucleótido proximal. Las distancias átomo a átomo se dan en Å. ( c ) Sitio de unión de nucleótidos distal. (d) Arriba: módulo de unión de zinc 2. Abajo: módulo de unión de zinc 3. (e) Estructura cristalina de Ecm16 de Streptomyces lasalocidi (PDB ID: 7SH1), UvrA de Bacillus stearothermophilus (PDB ID: 2R6F) y UvrA2 de Deinococcus radiodurans (ID PDB: 2VF8).

Ecm16 tiene un total de cuatro sitios de unión a nucleótidos, dos sitios de unión a nucleótidos proximales y dos distales (Fig. 1a). El sitio de unión de nucleótidos proximal se encuentra a ~ 19 Å de la interfaz del dímero Ecm16 y está intercalado entre el dominio de unión a ATP I y el dominio de firma II. El sitio de unión de nucleótidos distal se encuentra a ~ 26 Å de la interfaz del dímero y está intercalado entre el dominio II de unión a ATP y el dominio de firma I. Cada dominio de unión a ATP contiene un motivo Walker A, un motivo Walker B y la hélice α. Subdominio de la firma ABC que contiene la secuencia LSGGQ que normalmente se encuentra en los transportadores ABC16 y las proteínas de reparación del ADN17. Los dominios de unión y firma de ATP están conectados por el bucle Q, que es el sitio de mayor cambio conformacional y acoplamiento de los dominios de conversión de energía de NBD en otras ATPasas18. La densidad de electrones en los sitios de unión de nucleótidos proximales y distales mostró la presencia de ADP (Fig. 4 complementaria). Para confirmar aún más la identidad del nucleótido unido a Ecm16, realizamos un análisis de cromatografía líquida del extracto de proteína. Solo se detectó ADP en este experimento (Fig. 5 complementaria), lo que indica que el nucleótido observado en la estructura cristalina de Ecm16 es ADP y no ATP.

Los iones Mg2+ se observan solo en los dos sitios de unión de nucleótidos proximales, y no en los sitios distales, aunque Ecm16 se cristalizó en presencia de MgCl2 10 mM (Fig. 1b, c). La razón de esto no está clara, pero se hizo una observación similar para la estructura cristalina de UvrA de Bacillus stearothermophilus19. Los grupos fosfato de ADP participan en una extensa red de enlaces de hidrógeno que involucra los residuos del motivo Walker A, mientras que el azúcar de ribosa y la base de adenina forman relativamente pocas interacciones con Ecm16. El residuo de histidina conservado en la posición 501 se apila bien contra el anillo de adenina de ADP en el sitio distal. Cada protómero Ecm16 contiene dos módulos de unión a zinc, que corresponden a los módulos 2 y 3 de unión a zinc de UvrA observados en todas las estructuras cristalinas de UvrA informadas hasta el momento. En el módulo 2, Zn2+ se coordina con C176, C179, C296 y C299, mientras que en el módulo 3, Zn2+ se coordina con C589, C592, C612 y C615 (Fig. 1d). Estos residuos de coordinación de zinc se conservan en las proteínas UvrA y UvrA214,15.

La estructura tridimensional de Ecm16 se asemeja a la de UvrA de B. stearothermophilus (RMSD = 2,6 Å para 1002 átomos de Cα) y UvrA2 de Deinococcus radiodurans (RMSD = 1,7 Å para 933 átomos de Cα) (Fig. 1e, Fig. 6 complementaria) . La similitud estructural de Ecm16, UvrA y UvrA2 explica sus funcionalidades comunes, como la unión al ADN y la hidrólisis de ATP15,20. Sin embargo, Ecm16, como UvrA2, carece del dominio de unión a UvrB y su módulo 1 de unión a zinc asociado que se encuentran en todas las proteínas UvrA, lo que indica que Ecm16 no interactúa con UvrB de la vía NER. Esto es consistente con nuestro informe anterior de que tanto el tipo salvaje como las cepas knockout de UvrB de E. coli K12 se volvieron resistentes a la equinomicina tras la inducción de la expresión de ecm16 codificado en trans14.

Se ha propuesto que el dominio de inserción de UvrA y UvrA2 contribuye a la unión del sustrato de ADN15,20,21. Para probar si se requiere el dominio de inserción de Ecm16 para la unión al ADN, preparamos Ecm16-ΔID en el que el dominio de inserción se reemplazó con un enlazador de glicina-serina (Figuras complementarias 7, 8). Supervisamos la unión de Ecm16 y Ecm16-ΔID a un ADN de 32 pb que contiene un solo sitio de unión de equinomicina (Tabla complementaria 2). El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) mostró que Ecm16 se unía más estrechamente al ADN unido a equinomicina que al ADN normal, mientras que Ecm16-ΔID no se unía a ningún tipo de ADN (Fig. 2a). A continuación, medimos la afinidad de unión al ADN de Ecm16 y Ecm16-ΔID mediante polarización de fluorescencia. La constante de disociación para Ecm16-DNA-equinomicina y Ecm16-DNA fue de 11, 8 nM y 60, 2 nM, respectivamente (Fig. 2b, Tabla 3). Para Ecm16-ΔID, no se observó unión para ninguno de los sustratos de ADN. Por lo tanto, EMSA y la polarización de fluorescencia mostraron que el dominio de inserción de Ecm16 es necesario para la unión al ADN.

El dominio de inserción de Ecm16 es necesario para la resistencia a la equinomicina. ( a ) Actividad de unión al ADN de las proteínas Ecm16 de tipo salvaje y variantes analizadas mediante el ensayo de cambio de movilidad electroforética. La mezcla de reacción contenía ADN o ADN-equinomicina (marcado como asterisco) en ausencia (carril 1 y 2) o presencia de Ecm16, Ecm16-ΔID y Ecm16* 100, 200 y 300 nM. Los geles originales se presentan en la figura complementaria 9. ( b ) Actividad de unión al ADN de las proteínas Ecm16 de tipo salvaje y variante analizadas mediante un ensayo de polarización de fluorescencia. Se incubaron ADN de 32 pb marcado con fluoresceína 50 nM (arriba) y ADN de equinomicina 50 nM (abajo) con cantidades crecientes de proteína. Las barras de error representan la desviación estándar de tres experimentos independientes. ( c ) Actividad de hidrólisis de ATP específica de Ecm16, Ecm16 * y UvrA en presencia de ADN 1 µM, ADN-equinomicina, ADN-fluoresceína y ADN-doxorrubicina. Las barras de error representan la desviación estándar de tres experimentos independientes. (d) Determinación de la resistencia a la equinomicina. Curva de crecimiento de células de E. coli (K12) que portan plásmidos p(VCO), p(ecm16), p(ecm16-ΔID) y p(ecm16*) de control de vector únicamente en ausencia o presencia de equinomicina 10 µM . Las parcelas son representativas de tres repeticiones independientes.

A continuación, preparamos Ecm16 * en el que el dominio de inserción de Ecm16 se intercambió con el dominio de inserción de DrrC, un homólogo de Ecm16 de Streptomyces peucetius (Figuras complementarias 7, 8). Se informó que DrrC confiere resistencia contra el antibiótico monointercalador de ADN daunorrubicina, aunque se desconoce el mecanismo molecular de DrrC22. El dominio de inserción de Ecm16 y DrrC comparten una identidad de secuencia de aminoácidos del 32 %. Ecm16* se unió al ADN que contenía equinomicina 2,4 veces más estrechamente que al ADN normal (KD = 37,7 nM frente a 90,8 nM) (Fig. 2b, Tabla 3). Este resultado indica que tener un dominio de inserción homólogo es suficiente para que Ecm16 distinga el ADN unido a equinomicina del ADN normal a través de la unión diferencial. Para investigar si Ecm16* tiene actividad anti-equinomicina, las células E. coli K12 que expresan Ecm16* se expusieron a equinomicina 10 µM. Las células que expresan Ecm16* fueron sensibles a la equinomicina (Fig. 2d), lo que indica que el dominio de inserción nativo debe estar presente para proporcionar actividad anti-equinomicina.

Anteriormente informamos que la actividad de hidrólisis de ATP de Ecm16 es necesaria para generar resistencia a la equinomicina in vivo14. Debido a que Ecm16* se unía preferentemente al ADN que contenía equinomicina pero no confería resistencia a la equinomicina, predijimos que Ecm16* no podía hidrolizar ATP. Para probar esta idea, medimos la actividad de hidrólisis de ATP de Ecm16, Ecm16-ΔID, Ecm16* y UvrA en presencia de ADN libre de fármaco, ADN unido a equinomicina, ADN modificado con fluoresceína y ADN unido a doxorrubicina (Tabla complementaria 2). El ADN unido a equinomicina es el supuesto sustrato nativo de Ecm16, el ADN modificado con fluoresceína imita el ADN dañado por UV y es un sustrato conocido para UvrA pero no Ecm1614,20, y el ADN unido a doxorrubicina es el supuesto sustrato de DrrC23. La actividad de hidrólisis de ATP de Ecm16 aumentó 16 veces en presencia de ADN unido a equinomicina pero no en otros sustratos de ADN que probamos (Fig. 2c). Ecm16* y UvrA mostraron una actividad ATPasa basal similar para los cuatro sustratos de ADN. Ecm16-ΔID no mostró una actividad de hidrólisis de ATP significativa para todos los sustratos de ADN (Fig. 10 complementaria), lo que es consistente con la incapacidad de Ecm16ΔID para unirse al ADN (Fig. 2a, b). Estos resultados indican que solo el sustrato de ADN nativo estimula la actividad de hidrólisis de ATP de Ecm16 y que esta propiedad se pierde cuando se elimina el dominio de inserción o cuando se sustituye por el dominio de inserción de una proteína homóloga. Por lo tanto, el dominio de inserción juega un papel importante en la determinación de la especificidad de sustrato de Ecm16 y en el apoyo a la actividad anti-equinomicina de Ecm16.

Probamos la especificidad del sustrato de Ecm16 probando si Ecm16 puede proporcionar resistencia contra otras moléculas de fármacos que se unen al ADN: doxorrubicina, mitomicina C, daunorrubicina, actinomicina D, cisplatino, tiocoralina, quinaldopeptina y sandramicina. Debido a que la permeabilidad de estos compuestos es limitada en bacterias Gram negativas (diderm), utilizamos la bacteria Gram positiva (monoderm) Brevibacillus choshinensis, en lugar de E. coli K12. Las células de B. choshinensis que expresan Ecm16 mostraron resistencia solo contra los antibióticos bisintercaladores de ADN equinomicina, tiocoralina, quinaldopeptina y sandramicina (Fig. 3). El grado de resistencia proporcionado por Ecm16 fue más pronunciado a la concentración de antibiótico más alta probada. Las células que contenían el vector de control crecieron muy lentamente en presencia de equinomicina 0,1 µM, tiocoralina 4 µM, quinaldopeptina 6 µM o sandramicina 2 µM, lo que hizo imposible determinar el tiempo de duplicación, mientras que las células que expresaban Ecm16 tenían tiempos de duplicación que eran más similares a las células que no fueron tratados con el antibiótico respectivo (solo 1,1 a 1,2 veces más) (Fig. 3). Nuestro resultado mostró que Ecm16 es más efectivo contra la equinomicina, pero también proporciona cierta resistencia contra otros antibióticos de quinomicina estructuralmente similares.

Estudio de la curva de crecimiento de cepas de B. choshinensis con pNI vector-control-only (VCO) o plásmido ecm16_pNI. Las células se cultivaron en medio 2SY suplementado con 50 µg/ml de antibiótico de neomicina. La cepa de B. choshinensis se incubó con las concentraciones indicadas de ADN de equinomicina (0,025, 0,05, 0,1 µM), tiocoralina (0,5, 2,0, 4,0 µM), quinaldopeptina (1,5, 3,0, 6,0 µM) y sandramicina (0,5, 1,0, 2,0 µM) bis-intercaladores. Las barras de error representan la desviación estándar de tres experimentos independientes.

Aquí informamos la estructura cristalina de Ecm16 del productor de equinomicina S. lasalocidi. Ecm16 es un homólogo de UvrA, la proteína sensora de daños en el ADN de la vía NER procariótica. La principal diferencia estructural entre Ecm16 y UvrA es que Ecm16 carece del dominio de unión a UvrB y un módulo de unión a zinc que están presentes en todas las estructuras de UvrA notificadas hasta la fecha (PDB ID: 2R6F, 3PIH, 3UWX, 3UX8, 3ZQJ, 6N9L). Otra posible diferencia estructural es la conformación del dominio de inserción de ~ 100 residuos, aunque esto queda por verificar ya que el dominio de inserción no es visible en la estructura cristalina de Ecm16, presumiblemente porque este dominio es móvil en ausencia de un sustrato de ADN unido. En general, la estructura tridimensional de Ecm16 y UvrA es muy similar. Comparten el mismo pliegue de proteína y ambos contienen cuatro sitios de unión a ATP y un surco continuo de unión a ADN. En consecuencia, Ecm16 y UvrA muestran actividad ATPasa y se unen a DNA14 de doble cadena. Sin embargo, Ecm16 carece del dominio de unión a UvrB y su módulo de unión de zinc asociado, lo que sugiere que Ecm16 y UvrA tienen mecanismos moleculares distintos adquiridos potencialmente a través de una evolución divergente.

Ecm16ΔID, que carece del dominio de inserción, no pudo unirse al ADN. Además, la expresión de Ecm16ΔID en E. coli K12 no protegió a las células de la equinomicina. Ecm16*, que posee el dominio de inserción de la proteína de resistencia a la daunorrubicina DrrC, mostró una afinidad de unión 2,4 veces mayor al ADN unido a equinomicina que al ADN normal. Sin embargo, Ecm16*, en contraste con Ecm16, no mostró el aumento dramático en la tasa de hidrólisis de ATP en presencia de ADN que contenía equinomicina. Sobre la base de estos resultados, proponemos un modelo de dos pasos para la detección de ADN unido a equinomicina por Ecm16. En el primer paso, Ecm16 discrimina el ADN unido a equinomicina del ADN normal por afinidad diferencial de unión al ADN. Este paso de selección inicial requiere la presencia del dominio de inserción independiente de la secuencia. En el segundo paso, los sustratos de ADN unidos a Ecm16 se discriminan aún más por su capacidad para estimular la actividad ATPasa de Ecm16. Este segundo paso parece requerir un dominio de inserción que coincida específicamente con la equinomicina. Se necesitan estudios estructurales adicionales para determinar cómo se logran estos dos pasos a nivel molecular. En particular, la estructura atómica de Ecm16 en complejo con ADN unido a equinomicina y con ADN libre de equinomicina ayudará a descifrar el mecanismo molecular. Curiosamente, Ecm16 también proporcionó protección contra los bisintercaladores de ADN de productos naturales tiocoralina, quinaldopeptina y sandramicina. Esto recuerda la capacidad de la proteína UvrA para detectar una amplia variedad de lesiones en el ADN.

Comprender los mecanismos de resistencia a los antibióticos es importante porque permite el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Nuestro trabajo ha comenzado a desentrañar un mecanismo de resistencia a los antibióticos potencialmente novedoso, pero se necesitan más estudios para comprender completamente cómo Ecm16 confiere resistencia a la equinomicina. Esto incluye determinar la estructura de Ecm16 unida a varios sustratos de ADN e identificar, si las hay, las proteínas asociadas de Ecm16. Suponiendo que Ecm16 requiere proteínas asociadas, es probable que sean proteínas que se conservan a lo largo de diferentes linajes filogenéticos, ya que Ecm16 confiere resistencia a la equinomicina cuando se expresa en tres organismos relacionados de forma lejana, S. lasalocidi, E. coli y B. choshinensis.

Las cepas y los plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla S4. Se utilizó la cepa E. coli DH5α (Invitrogen) para la clonación y la propagación de plásmidos, mientras que los estudios de la curva de crecimiento se realizaron utilizando la cepa E. coli (K12) (Invitrogen). Se utilizó caldo Luria-Bertani (LB) (Difco) con el antibiótico apropiado para hacer crecer cultivos de E. coli a 37 °C con aireación constante y agitación a 200 rpm. Las cepas de E. coli cultivadas en medios sólidos se sembraron en agar LB (Fisher BioReagents) y se incubaron a 37 °C. Se añadió l-arabinosa al 0,2 % (Alfa Aesar) para la inducción de la expresión génica en cultivos de crecimiento de LB. La cepa B. choshinensis (Takara Bio) se cultivó en MT (10 mg ml−1 de glucosa, 10 mg ml−1 de peptona de fitona, 35 % de extracto de bonito ehrlich, 2 mg ml−1 de extracto de levadura etiqueta azul, 10 µg ml−1 de FeSO4 , 10 µg ml−1 MnSO4, 1 µg ml−1 ZnSO4, 4,1 µg ml−1 MgCl2) medios. Para los estudios de la curva de crecimiento, la cepa B. choshinensis se cultivó en medio líquido 2SY (20 mg ml−1 glucosa, 40 mg ml−1 bacto soytone, 5 mg ml−1 extracto de levadura bacto, 150 µg ml−1 CaCl2) a 37 ° C con agitación a 200 rpm. Se mantuvieron células de E. coli y B. choshinensis que albergaban diferentes plásmidos en presencia de ampicilina (50 µg ml−1 de medio líquido y 100 µg ml−1 de medio sólido para E. coli) y neomicina (50 µg ml−1 para B. choshinensis ). Las cepas de B. choshinensis se mantuvieron como cultivos madre a -80 °C. Los cultivos madre se congelaron en medio LB que contenía glicerol al 40%.

Los genes con codones optimizados para ecm16 y ecm16-ΔID se subclonaron en el vector pUC19 utilizando los sitios NdeI y EcoRI (GenScript) para la expresión en E. coli. Los genes se digirieron usando las enzimas NdeI y EcoRI y se purificaron en gel. El vector de expresión pET28a (+) se cortó con NdeI y EcoRI y se purificó en gel. Los insertos ecm16 y ecm16-ΔID se ligaron en el vector pET28a(+) en una proporción de inserto:vector de 3:1 usando el Quick Ligation Kit (New England Biolabs Inc). Los productos de ligación se transformaron en células E. coli DH5α químicamente competentes y se cultivaron durante la noche en placas LB-kan (50 µg ml-1) a 37 °CE. Las células coli BL21 (DE3) (Novagen) se transformaron con el vector de expresión y luego se cultivaron para fase exponencial a 37 °C en medio Luria Bertani (LB) que contiene 50 µg/ml de kanamicina. Ecm16* se clonó en el vector pET28a (+) usando el mismo procedimiento usando las enzimas de digestión de restricción EcoR1 y HindII en el sitio 5' y 3' respectivamente. La expresión de ecm16 se indujo usando isopropil-d-1-tiogalactopiranósido 0,25 mM (Thermo Scientific) a una densidad óptica a una DO600 de 0,6–0,8. Las células se cultivaron más durante 16 h a 18 °C y luego se recolectaron mediante centrifugación a 6000 × g durante 15 min a 4 °C. El sedimento celular se resuspendió en tampón de lisis (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, imidazol 10 mM y glicerol al 5 % (v/v), fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, DNasa 10 µg/ml y MgCl2 10 mM) y se lisó mediante sonicación El lisado celular se centrifugó a 30 000 × g durante 60 min a 4 °C y se eliminó el material insoluble. La fracción soluble se cargó en una columna de Ni-NTA de 5 ml (GE Healthcare) que se equilibró con tampón de unión (HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 200 mM), se lavó con 250 ml de tampón de lavado (HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 200 mM , imidazol 30 mM y glicerol al 5% (v/v), y la proteína unida se eluyó con tampón de elución (HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 200 mM, imidazol 250 mM). La solución de proteína eluida se aplicó a una columna HiTrap QHP HP de 5 ml (GE Healthcare), y la proteína unida se eluyó usando un gradiente lineal de NaCl de 50–500 mM. Por último, las muestras de Ecm16 se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño en HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 50 mM utilizando un Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare). La pureza de la proteína se ensayó mediante SDS-PAGE. Las muestras de proteínas se concentraron usando un filtro centrífugo Amicon 10-kDa MWCO. Todos los pasos de purificación se realizaron a 4 °C. Las variantes Ecm16-ΔID y Ecm16* se prepararon de la misma manera que la proteína Ecm16 de tipo salvaje.

Para estudios in vivo usando E. coli, se amplificaron ecm16 y ecm16-ΔID con codones optimizados de vectores pET28a construidos previamente con sitios SacI y EcoRI usando polimerasa Phusion (New England Biolabs). Los genes se separaron electroforéticamente en un gel de agarosa al 0,7% y se purificaron en gel. Después de la purificación, los genes se digirieron con SacI y EcoRI (New England Biolabs) y se clonaron en un vector pBAD-Myc-HisA digerido de manera similar (Thermo Fisher). Después de la digestión, el vector se trató con fosfatasa alcalina de camarón (New England Biolabs). Tanto el vector digerido como los fragmentos digeridos se separaron electroforéticamente en un gel de agarosa al 0,7 % y se purificaron en gel nuevamente. en placas LB-amp (100 µg ml−1) a 37 °CE, se transformaron células coli BW25113 (Coli Genetic Stock Center) con el vector de expresión y luego se cultivaron hasta la fase exponencial a 37 °C en medio LB que contenía 50 µg/ml de ampilcilina . La construcción de células BW25113 con ecm16* se realizó de manera similar a BW25113-ecm16 y BW25113-ecm16-ΔID, con la excepción de que se usaron sitios HindIII y EcoRI para la digestión de restricción.

El gen UvrA de Thermotoga maritima se codificó en el vector pET28a (+) y se transformó en células pLysS de E. coli Rosetta (DE3). La expresión de proteínas se indujo utilizando isopropil-ß-D-galactósido (IPTG) 50 µM y se incubó durante 5 ha 30 °C. Las células bacterianas se resuspendieron en tampón que contenía Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, ditiotreitol (DTT) 2 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM y glicerol al 5% (v/v) y se sonicaron. El lisado se centrifugó a 18.000 rpm durante 45 min y el sobrenadante se aplicó en una columna cruda His-Trap de 5 ml (GE Healthcare). UvrA se eluyó con un gradiente de 200 ml de imidazol de 0 a 500 mM de concentración. La proteína purificada se diluyó con tampón que contenía Tris 50 mM pH 8,0, DTT 2 mM y glicerol al 5 % (v/v) y se aplicó a una columna HiTrap Q HP de 5 ml (GE Healthcare). UvrA se eluyó con 50 ml de un gradiente lineal de NaCl de 50 mM a 1 M. La proteína se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrado con tampón que contenía Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 200 mM, DTT 2 mM y glicerol al 5% (v/v). El volumen de la muestra de proteína recogida se redujo a una concentración final de 10 mg/ml y se congeló rápidamente en nitrógeno líquido.

Los cristales de Ecm16 se cultivaron a 18 °C mediante difusión de vapor usando el método de gota colgante mezclando 1 µl de solución de proteína (8 mg ml−1 Ecm16, 10 mM MgCl2, 1 mM ADP) con 1 µl de tampón de equilibrio (0,1 M MES pH 6,5, tiocianato de sodio 0,2 M y PEG al 12% (p/v) 20 K). Los cristales se transfirieron al mismo tampón que incluía etilenglicol al 20% v/v antes de la congelación instantánea.

Los experimentos iniciales de difracción de rayos X se llevaron a cabo en la fuente de luz de radiación de sincrotrón de Stanford. El conjunto final de datos de difracción de rayos X se recopiló en la línea de luz 17-ID-B de la fuente de fotones avanzada, Laboratorio Nacional de Argonne y se procesó con autoPROC24. El reemplazo molecular se realizó utilizando PHASER25 y la estructura UvrA2 (PDB: 2VF7)15 como modelo de búsqueda. El refinamiento de la estructura se realizó utilizando PHENIX26 y REFMAC27. La construcción del modelo se realizó usando COOT28 con sesiones alternas de refinamiento usando PHENIX26.

El gen ecm16 con codones optimizados para la expresión en B. choshinensis se sintetizó (GenScript) y se insertó en el vector pUC19 usando los sitios BamHI y XbaI. pNI, un vector lanzadera entre B. choshinensis y E. coli, se adquirió de Takara Bio. El vector pNI está bajo el promotor P2, que es una parte de la secuencia 5' cadena arriba de la proteína de la pared celular, que se expresa fuertemente en B. choshinensis. ecm16 se insertó en el vector pNI siguiendo el protocolo de ligamiento descrito anteriormente. Los productos de ligación se transformaron en células de E. coli DH5α químicamente competentes y se cultivaron durante la noche en placas LB-amp (50 µg ml−1) a 37 °C. El clon ecm16_pNI se verificó realizando digestión con enzimas de restricción utilizando BamHI y XbaI. Los plásmidos ecm16_pNI o pNI se transformaron en B. choshinensis utilizando el método New Tris-PEG (NTP) siguiendo las pautas del fabricante (Takara Bio)29. Brevemente, se añadieron 100 ng de plásmido mezclado con la solución A (Takara Bio) al sedimento de células de B. choshinensis competente y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, se añadió la solución B que contenía PEG, se agitó y se centrifugó. El sedimento celular se resuspendió en medio MT, seguido de incubación a 37 °C durante 3 h. Luego, las células se sembraron en placas de agar MT que contenían neomicina (50 µg ml−1) y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Se inocularon 4–5 colonias en 3 ml de medio líquido 2SYNm y se cultivaron a 30 °C durante 48 h con agitación orbital a 120 rpm. Las células se centrifugaron y los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón fosfato 1X (fosfato sódico 100 mM a pH 7,0). La expresión de Ecm16 en B. choshinensis se confirmó mediante análisis SDS-PAGE.

Se prepararon soluciones madre de equinomicina 908 µM (MilliporeSigma) y tiocoralina 864 µM (Cayman Chemical) en metanol. Se prepararon soluciones madre de quinaldopeptina 805 µM (Cayman Chemical) y sandramicina 819 µM (Cayman Chemical) en DMSO. Para la curva de crecimiento y los estudios bioquímicos, todos los compuestos se diluyeron usando H2O. Para los experimentos de la curva de crecimiento de E. coli, los cultivos se cultivaron durante la noche en medio líquido LB suplementado con 30 µg ml−1 de ampicilina a 37 °C y 200 rpm. El cultivo saturado se indujo con una solución de arabinosa al 0,2 % durante 30 min y se usó para inocular 2 ml de muestras duplicadas a 0,02 OD600 en tubos de vidrio de 13 mm. Se tomaron lecturas de DO600 cada 30 min durante 6 h. Para el perfil de crecimiento de B. choshinensis en medios 2SYNm, se midió la DO600 utilizando un lector de placas de pocillos múltiples (Synergy HT, BioTek). Por lo general, se utilizaron 3 µl del cultivo nocturno con una DO600 de 1,0–1,2 para inocular un pocillo que contenía 200 µl de medio 2SYNm fresco y se controló el crecimiento cada 30 min durante 10 h en una placa de 96 pocillos.

El sustrato de ADN de 32 pb purificado con PAGE (Integrated DNA Technologies) se disolvió en tampón de hibridación (HEPES 30 mM, pH 7,5, acetato de potasio 100 mM). Este ADN contenía el sitio de unión de equinomicina 5 'ACGT 3' (Tabla S2). El complejo de equinomicina-ADN se formó incubando equinomicina y ADN en una proporción molar de 1,1: 1. Se incubaron diferentes concentraciones de Ecm16, Ecm16-ΔID, Ecm16* purificados (0, 100, 200 y 300 nM) con ADN 50 nM en el presencia o ausencia de equinomicina en tampón de unión (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, albúmina de suero bovino 0,1 mg ml−1) durante 15 min a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se separó en un gel de poliacrilamida nativa al 6 % a 4 °C usando TBE 1x (acetato de Tris 40 mM, EDTA 0,5 mM) como tampón de funcionamiento durante 30 min a 40 mA. Los geles se tiñeron con tinción de ácido nucleico dorado 1x SYBR en tampón TBE 1x y se tomaron imágenes con un transiluminador ultravioleta (Azure c200).

El oligonucleótido de ADN de 32 pb marcado con fluoresceína (Integrated DNA Technologies) se disolvió en tampón de unión (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM) y se dividió en alícuotas hasta una concentración final de 50 nM en el pocillo de reacción. Ecm16 o Ecm16-ΔID o Ecm16* purificados en presencia o ausencia de equinomicina se diluyeron en serie en tampón de unión y se añadieron a cada pocillo de reacción hasta un volumen final de 100 µl a una concentración que oscilaba entre 4 y 512 nM. Para detectar el cambio en la polarización de la luz del ADN marcado con FAM, se realizaron mediciones fluorescentes en un formato de 384 pocillos en una placa negra de bajo volumen (Corning) usando un lector de placas Synergy HT (BioTek) con longitudes de onda de excitación y emisión de 490 nm y 520 nm, respectivamente. Los valores de polarización informados son el promedio de tres experimentos independientes. Los datos se analizaron en Graph Pad Prism 5 utilizando la ecuación de Hill. Las constantes de disociación calculadas (KD) se enumeran en la Tabla 3.

La actividad ATPasa de las proteínas purificadas se determinó utilizando el kit de ensayo de fosfato EnzChek™ (Thermo Fisher). En este ensayo, el nucleósido fosforilasa de purina (PNP) utiliza fosfato inorgánico producido a partir de la hidrólisis de ATP para convertir 2-amino-6-mercapto-7-metilpurina (MESG) en ribosa 1-fosfato y 2-amino-6-mercapto-7. -metilpurina. Se sigue la formación del producto midiendo la absorbancia a 360 nm. Antes del ensayo de ATPasa, la equinomicina se incubó con ADN de 32 pb en una proporción molar de 1,1:1 durante 15 min a temperatura ambiente. El Ecm16 purificado (0,2 µM) se incubó con ADN 1 µM o complejo de equinomicina-ADN a diversas concentraciones de ATP (0,125, 0,325, 0,75, 1,0, 1,5 y 2,0 µM) en tampón de reacción (HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 50 mM, 10 MgCl2 mM). Se añadieron sustrato MESG (200 µM) y enzima PNP (500 µM) y se midió la absorbancia UV a 360 nm cada 30 s utilizando un lector de microplacas (Synergy HT, BioTek) a 22 °C. Para convertir la densidad óptica a 360 nm en la cantidad de ATP degradado, se construyó una curva de calibración trazando la DO360 nm con estándares de fosfato.

Las coordenadas de Ecm16 y los factores de estructura se han depositado en el Protein Data Bank con el código de acceso 7SH1.

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Agradecemos al Dr. Marcin Nowotny por proporcionar el plásmido de expresión para Thermotoga maritima UvrA. Los datos de difracción de rayos X se recopilaron en la fuente de fotones avanzada y en la fuente de luz de radiación de sincrotrón de Stanford. Fuente de fotones avanzados, una instalación para usuarios de la Oficina de Ciencias del DOE operada para la Oficina de Ciencias del DOE por el Laboratorio Nacional de Argonne bajo el Contrato No. DE-AC02-06CH11357. El uso de la fuente de luz de radiación de sincrotrón de Stanford, SLAC National Accelerator Laboratory, está respaldado por el Departamento de Energía de EE. UU., Oficina de Ciencias, Oficina de Ciencias Básicas de la Energía bajo el Contrato No. DE-AC02-76SF00515. El Programa de Biología Molecular Estructural de SSRL cuenta con el respaldo de la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental del DOE y de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (incluido P41GM103393). Este trabajo fue apoyado por el Premio STAR del Sistema de la Universidad de Texas (C.-YK), Proyectos de Cooperación Internacional en la Provincia China de Shaanxi 2023-GHYB-08 (XC), Programa de Proyecto Abierto del Laboratorio Estatal de Biología Tumoral Clave CBSKL2022KF13 (XC ).

Chu Young Kim

Dirección actual: Departamento de Bioquímica, Facultad de Biología Molecular y Celular, Universidad de Illinois Urbana-Champaign, Urbana, IL, EE. UU.

Departamento de Química y Bioquímica, Universidad de Texas en El Paso, El Paso, TX, EE. UU.

Priyanka Gade, Anwar Ullah y Chu Young Kim

Departamento de Microbiología, Facultad de Biología Molecular y Celular, Universidad de Illinois Urbana-Champaign, Urbana, IL, EE. UU.

Amanda Erlandson y Paola E. Mera

Laboratorio clave de moléculas funcionales sintéticas y naturales del Ministerio de Educación, Facultad de Química y Ciencia de los Materiales, Universidad del Noroeste, Xi'an, 710127, China

xi chen

Fuente de luz de radiación de sincrotrón de Stanford, SLAC National Accelerator Laboratory, Menlo Park, CA, EE. UU.

Irimpan I. Mathews

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PG, AU, XC, IIM y C.-YK realizaron experimentos de cristalografía de rayos X. PG, AE, PEM y C.-YK realizaron estudios bioquímicos y celulares. PEM y C.-YK diseñaron y supervisaron el estudio y analizaron los datos. PG y C.-YK escribieron el manuscrito con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Paola E. Mera o Chu-Young Kim.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Gade, P., Erlandson, A., Ullah, A. et al. Análisis estructural y funcional de la proteína Ecm16 que confiere resistencia a la equinomicina de Streptomyces lasalocidi. Informe científico 13, 7980 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34437-9

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Recibido: 14 Septiembre 2022

Aceptado: 29 de abril de 2023

Publicado: 17 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34437-9

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