Base estructural de los modos de unión de ligandos de EAAT2 humana - Grupo Co., Ltd de los laboratorios de minería de Foshan

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3329 (2022) Citar este artículo

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En el sistema nervioso central (SNC), los transportadores de aminoácidos excitatorios (EAAT) median la captación del neurotransmisor excitatorio glutamato y mantienen sus bajas concentraciones en la hendidura sináptica para evitar la citotoxicidad neuronal. La disfunción de las EAAT puede conducir a muchas enfermedades psiquiátricas. Aquí informamos estructuras crio-EM de EAAT2 humano en una conformación orientada hacia adentro, en presencia de glutamato de sustrato o inhibidor selectivo WAY-213613. El glutamato está coordinado por extensos enlaces de hidrógeno y más estabilizado por HP2. El inhibidor WAY-213613 ocupa un bolsillo de unión similar al del sustrato glutamato. Tras la asociación con WAY-213613, HP2 sufre un cambio conformacional sustancial y, a su vez, estabiliza la unión del inhibidor al formar interacciones hidrofóbicas. Los experimentos electrofisiológicos aclaran que el exclusivo S441 juega un papel fundamental en la unión de hEAAT2 con glutamato o WAY-213613, y el grupo I464-L467-V468 actúa como un determinante estructural clave para la inhibición selectiva de este transportador por WAY-213613.

El glutamato es el neurotransmisor excitatorio predominante, que desempeña un papel clave en el desarrollo del sistema nervioso central de los mamíferos y participa en la función cerebral normal, como la incorporación del aprendizaje, la cognición y la memoria1. Además, el exceso de glutamato puede provocar excitotoxicidad, que puede destruir las células neuronales a través de una estimulación excesiva de los receptores de glutamato2. Por lo tanto, es crucial mantener bajas concentraciones de glutamato en los fluidos extracelulares. Los EAAT se conocen como transportadores de aminoácidos excitatorios, incluidos cinco subtipos (EAAT1–EAAT5), que son responsables de la eliminación de glutamato de la hendidura sináptica al unir y transportar rápidamente glutamatos de regreso a la presinapsis o astrocitos, lo que contribuye a la terminación. de la actividad sináptica y al aclaramiento de glutamato extracelular potencialmente citotóxico3. Entre las cinco EAAT, la EAAT2 humana (hEAAT2) se expresa predominantemente en los astrocitos y se informó que es responsable del 90-95 % de la absorción de glutamato en el prosencéfalo mediante un mecanismo elevador3,4. Por lo tanto, hEAAT2 puede mantener niveles bajos de glutamato extracelular en la hendidura sináptica, que es una de las EAAT más importantes para proteger las neuronas5,6. La deficiencia de hEAAT2 causa muerte neuronal progresiva y enfermedades psiquiátricas o neurológicas, incluido el trastorno depresivo mayor, la epilepsia, la enfermedad de Alzheimer, el accidente cerebrovascular, la enfermedad de Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), por lo que hEAAT2 representa un objetivo terapéutico potencial6,7,8.

Los EAAT son estructuralmente similares al homólogo de arqueas GltPh, todos los cuales son homotrímeros compuestos por tres protómeros idénticos9,10. El protómero individual tiene ocho hélices transmembrana (TM 1–8) y dos bucles en horquilla (HP) organizados en dos dominios: el dominio de andamiaje comprende TM1, 2, 4 y 5, que es responsable de estabilizar el dominio de transporte; el dominio de transporte incluye TM 3, 6, 7 y 8, HP1 y HP2. Estudios previos han demostrado que la subunidad individual en EAAT puede transportar el sustrato de forma independiente11,12,13, y el sitio de unión al sustrato está constituido por la región central desenrollada de TM7 (motivo NMDGT), TM8 y puntas de HP1 y HP23,9.

Se han resuelto las estructuras de homólogos de arqueas (GltPh4,9,10,14,15,GltTk16,17,18) y cuatro transportadores SLC1 humanos (hEAAT119, hEAAT320, hASCT121 y hASCT222,23,24,25) y comparten alta conservación de la secuencia en el bolsillo de unión al ligando, incluidos TM7, TM8, HP1 y HP2. Sin embargo, aún es deseable determinar la estructura de hEAAT2, ya que comparte identidades de secuencia bajas con estos homólogos (34 % de identidad de secuencia con GltPh y GltTk, 50 % de identidad de secuencia con hEAAT1 y hEAAT3, 42 % y 39 % de identidad de secuencia con hASCT1 y hASCT2, respectivamente). WAY-213613 es un inhibidor potente y altamente selectivo de hEAAT2 (IC50 es 85 nM), que tiene una afinidad de 59 y 44 veces mayor que la de hEAAT1 y hEAAT3 (IC50 es 5 y 3,8 μM, respectivamente)26. Sin embargo, el mecanismo por el cual WAY-213613 inhibe de manera altamente selectiva el transporte de glutamato por parte de hEAAT2 sigue siendo difícil de alcanzar.

Aquí, informamos dos estructuras crio-EM de hEAAT2 trimérico en complejo con glutamato y WAY-213613, respectivamente. Ambas estructuras se determinan con una resolución de 3,4 Å y se estabilizan en el estado conformacional orientado hacia adentro. Estas estructuras aclaran la base estructural de cómo hEAAT2 reconoce el sustrato y cómo WAY-213613 inhibe selectivamente al transportador. Los experimentos electrofisiológicos se llevaron a cabo y confirmaron nuestras especulaciones.

Además de mediar en el transporte de aminoácidos excitatorios, hEAAT2 también actúa como un canal selectivo de aniones27,28,29. La corriente asociada a hEAAT2 incluye tres componentes: corriente de anión inducida por glutamato, corriente de fuga de anión dependiente de Na+ y corriente de transporte de glutamato30,31. Los inhibidores competitivos pueden bloquear los tres componentes de la corriente32. Para obtener más información sobre los sitios de unión del inhibidor y el glutamato, llevamos a cabo experimentos electrofisiológicos utilizando la técnica patch-clamp de células completas en condiciones similares a las descritas anteriormente25. En línea con los informes anteriores25,31,33, la aplicación de glutamato de sustrato aumentó las amplitudes de las corrientes de fuga de aniones (Figura complementaria 1a). Por el contrario, el WAY-213613 pudo bloquear la conductancia de fuga de aniones (Figura complementaria 1b). La activación de las corrientes de fuga de aniones mediadas por glutamato y la inhibición de las de WAY-213613 fueron dependientes de la dosis y podrían ajustarse a una ecuación de tipo Michaelis-Menten, dando una Km de 30 ± 2,5 μM para el glutamato y una Ki aparente. de 0.07 ± 0.03 μM para WAY-213613 (Fig. 1a, b), los cuales son consistentes con reportes previos26,34.

una relación dosis-respuesta de glutamato para la corriente asociada a hEAAT2 en presencia de glutamato 3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM, 300 μM y 1000 μM. Los tamaños de muestra (n) probados de concentraciones bajas a altas son 5, 5, 5, 5, 5 y 8 células. Las líneas representan el mejor ajuste a una ecuación similar a la de Michaelis-Menten con una Km aparente promedio de 30 ± 2,5 μM para el glutamato. Las corrientes se normalizaron a la corriente máxima registrada después de la aplicación de glutamato 1000 μM. b Relación dosis-respuesta de WAY-213613 para la corriente asociada a hEAAT2 en presencia de 0,01 μM, 0,03 μM, 0,1 μM, 0,3 μM, 1 μM, 3 μM y 30 μM WAY-213613. Los tamaños de muestra (n) probados de concentraciones bajas a altas son 5, 5, 5, 5, 5, 5 y 10 células. Las líneas representan el mejor ajuste a una ecuación similar a Michaelis-Menten con un Ki aparente promedio de 0,07 ± 0,03 μM para WAY-213613. Las corrientes se normalizaron a la corriente máxima registrada después de la aplicación de 30 μM WAY-213613. En las figuras ayb, todos los experimentos se ejecutaron a 0 mV y los datos se presentaron como valores medios ± SD. c Representación de dibujos animados del homotrímero hEAAT2 visto desde el citoplasma. Las líneas sólidas dividen el homotrímero en tres protómeros individuales y las líneas curvas discontinuas delimitan el dominio de transporte de cada protómero. Cada protómero consta del dominio de andamiaje (trigo) y el dominio de transporte (verde pálido). Se resaltan los elementos estructurales HP1 (azul) y HP2 (rojo). Se adopta el mismo esquema de color en todo el manuscrito a menos que se indique específicamente. d Estructura de un solo protómero vista desde el plano de la membrana. El dominio de transporte y HP1 y HP2 se muestran como dibujos animados, mientras que el dominio de andamiaje se muestra como cilindros. En las figuras c y d, los límites de la membrana celular están representados por líneas grises y la información de las dimensiones está etiquetada junto a las flechas.

Para dilucidar las características estructurales de hEAAT2, expresamos y purificamos el hEAAT2 de tipo salvaje en células HEK293 (Fig. 1c complementaria). Los estudios crio-EM se llevaron a cabo en presencia del sustrato glutamato y el inhibidor WAY-213613, generando dos mapas de 3.4 Å (Figuras complementarias 2, 3 y Tabla complementaria 1). hEAAT2 tiene una estructura de homotrímero que se asemeja a otros EAAT (hEAAT119 y hEAAT320) y sus ortólogos (hASCT121 y hASCT222,23,24,25) o parálogos (GltPh4,9,10,14,15 y GltTk16,18). Cada subunidad del trímero hEAAT2 tiene ocho hélices transmembrana (TM1-TM8) y un par de medias horquillas en espiral transmembrana (HP1, HP2) (Fig. 1c, d). Estas estructuras secundarias se ensamblan en un dominio de andamiaje (TM1, 2, 4, 5 y dos láminas beta extracelulares insertadas en TM4b y TM4c) y un dominio de transporte (TM3, 6–8 y HP1, HP2), respectivamente. Cada uno de los dos dominios exhibe una doble simetría interna reconocible. El dominio de andamiaje de cada protómero individual se conecta con los de los otros dos protómeros, lo que constituye una integración bastante estable en la parte central del homotrímero. Y el dominio de transporte está separado por su propio dominio de andamiaje y distribuido como un triángulo equilátero (Fig. 1c). En nuestras estructuras hEAAT2, el HP1 está situado aproximadamente paralelo al plano de la membrana y casi todo expuesto en el citoplasma (Fig. 1d). La contraparte HP2 está incrustada en la bicapa lipídica y la punta de HP2 es accesible al solvente desde el lado citoplásmico (Fig. 1d). El hEAAT2 tiene una longitud de ~ 97 Å y un ancho de ~ 100 Å a lo largo de la normal al plano de la membrana, y ~ 70 Å a lo largo de la normal de la membrana (Fig. 1c, d).

Debido a la alta resolución de dos estructuras resueltas de hEAAT2, se observaron muchas densidades en forma de tira que se distribuyen alrededor de la proteína (Fig. 4a, b complementarias). Los lípidos más abundantes se encuentran entre las dos subunidades adyacentes del trímero hEAAT2, lo que es similar a la distribución de lípidos que se encuentran en las estructuras de hASCT2 (6RVX)23 o GltPh (6 × 15)14. Durante la preparación de muestras de hEAAT2, encontramos que CHS tiene un impacto significativo en la homogeneidad y el perfil SEC de hEAAT2, como se informó en un escenario similar en hASCT220. De hecho, se determina que las densidades similares a CHS están ubicadas en la cavidad formada por TM3, TM6 y TM8 en el lóbulo interno de la membrana plasmática (Fig. 4c, d complementaria), que también se encontró en los mapas de hEAAT335 y GltPh14 (6S3Q y 6 × 15, respectivamente), lo que sugiere que el colesterol puede estar relacionado con el ensamblaje o la función de los transportadores SLC1 y sus homólogos.

Los EAAT de mamíferos transportan l-glutamato, l-aspartato y d-aspartato con aparentes afinidades micromolares3. Para comprender cómo se une hEAAT2 con el glutamato, determinamos la estructura de hEAAT2 en complejo con el glutamato (hEAAT2Glu) a una resolución de 3,4 Å (Fig. 2 complementaria). En la estructura hEAAT2Glu, el glutamato está sellado por las puntas de los bucles HP1 y HP2 (Fig. 2a, b). Usando el dominio de andamiaje como referencia, realizamos una comparación estructural entre las estructuras hEAAT1Asp (PDB ID: 5LLU)19 que miran hacia afuera y las estructuras hEAAT2Glu y encontramos que el dominio de transporte de la estructura hEAAT2Glu se desplaza ~ 17 Å a través de la membrana hacia el citoplasma. lado en relación con el de hEAAT1Asp, lo que sugiere que la estructura de hEAAT2Glu está determinada en una conformación orientada hacia adentro (Fig. 5 complementaria). Tal cambio conformacional del dominio de transporte también es consistente con observaciones previas24. En la ubicación de los residuos polares altamente conservados de una región desenrollada de TM7 (motivo 10 NMDGT), el TM8 anfipático forma una amplia gama de interacciones fuertes (principalmente interacciones de enlaces de hidrógeno) con glutamato para estabilizar la unión de este último a hEAAT2 (Fig. 2a). Específicamente, el grupo α-carboxilo del sustrato glutamato forma contactos con las cadenas laterales de T479TM8 y N482TM8, y la cadena principal N de S364HP1 en la punta de HP1. El grupo amino del sustrato glutamato se coordina solo con el grupo carboxilo de D475TM8. El grupo δ-carboxilo del sustrato glutamato interactúa con las cadenas laterales de T401TM7 y R478TM8 (Fig. 2c, d). En comparación con los homólogos eucarióticos (hEAAT119, hEAAT320, hASCT222) y los homólogos procarióticos (GltPh14, GltTk17), los residuos clave involucrados en la unión al sustrato están altamente conservados entre hEAAT2 y los homólogos mencionados anteriormente (Figura 6 complementaria). Sin embargo, R478TM8 en hEAAT2 se sustituye por C467TM8 en la posición correspondiente en el transportador de aminoácidos neutros hASCT2 (Fig. 6e complementaria), lo que contribuye a la selectividad de sustrato de hASCT2 por aminoácidos neutros20. Para validar el sitio de unión del glutamato, mutamos D475TM8 y R478TM8 a alanina por separado (D475ATM8 y R478ATM8). Los experimentos electrofisiológicos mostraron que el glutamato no logró activar las corrientes de aniones de estos dos mutantes a una concentración de glutamato de hasta 1 mM, en comparación con la de hEAAT2 de tipo salvaje (Fig. 2e y Fig. 7a-c complementaria). Para descartar la posibilidad de que la mutación en cualquiera de los residuos pueda interrumpir la actividad de hEAAT2 como canal de aniones, también probamos los efectos inhibidores de WAY-213613 en las corrientes de aniones de estos dos mutantes. Como resultado, ambos mutantes, D475ATM8 y R478ATM8, aún podían mediar una corriente aniónica de entrada, evidenciada por una corriente de salida aparente inducida por WAY-213613, aunque la Ki aparente de WAY-213613 se redujo a 30,48 μM y 1,68 μM para D475ATM8. y R478ATM8, respectivamente (Fig. 2f y Fig. 7e, f complementarias). Por lo tanto, especulamos que los residuos D475TM8 y R478TM8 son críticos para la unión de hEAAT2 con glutamato y también podrían participar en la unión de este transportador con WAY-213613.

a Estructura general del homotrímero hEAAT2Glu con glutamato (esferas de colores) vista desde el plano de la membrana. b Corte a través de la superficie molecular de un solo protómero de hEAAT2Glu mostrando glutamato (barras) y su densidad EM (malla azul). c Sitio de unión detallado para glutamato (amarillo) con sus principales residuos de interacción (barras). d Gráfica 2D que representa las interacciones del glutamato con sus residuos circundantes por LigPlot+. e Comparación de las densidades de corriente relacionadas con el glutamato entre los mutantes probados y la hEAAT2 de tipo salvaje. Las corrientes se registraron a 1000 μM de glutamato y se presentaron después de restar la corriente de fuga dependiente de Na+. Los tamaños de muestra (n) analizados para hEAAT2 de tipo salvaje, D475ATM8 o R478ATM8 son 5, 4, 5 células. ANOVA unidireccional fue seguido por la prueba post hoc de Bonferroni, ****P < 0,0001. f Relaciones dosis-respuesta de WAY-213613 para las corrientes mediadas por D475ATM8, R478ATM8 o S441GHP2. WAY-213613 se varió en las siguientes concentraciones: 0,3 μM, 1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM y 100 μM para D475ATM8 y R478ATM8; 0,03 μM, 0,1 μM, 0,3 μM, 1 μM, 3 μM, 10 μM y 30 μM para S441GHP2. Las corrientes se normalizaron a la corriente máxima registrada después de la aplicación de 30 μM o 100 μM WAY-213613. Los tamaños de muestra (n) probados de concentraciones bajas a altas se enumeran a continuación: n = 4, 5, 5, 5, 5 y 9 células para D475ATM8; n = 5, 5, 5, 4, 5 y 12 celdas para R478ATM8; n = 4, 4, 4, 5, 5, 4 y 7 celdas para S441GHP2. Las líneas representan los mejores ajustes a una ecuación tipo Michaelis-Menten. Los datos de hEAAT2 de tipo salvaje de la Fig. 1b se compararon con los de los mutantes probados. g Comparación estructural de los dominios de transporte entre hEAAT2Glu (verde pálido) y hEAAT3Apo (PDB ID: 6X3F, gris). h Relación dosis-respuesta de glutamato para las corrientes mediadas por S441GHP2 en las concentraciones variadas de 0,1 μM, 0,3 μM, 1 μM, 3 μM, 10 μM y 30 μM. Las líneas representan el mejor ajuste a una ecuación similar a Michaelis-Menten con una Km aparente promedio de 0,40 ± 0,03 μM. Las corrientes se normalizaron a la corriente máxima registrada después de la aplicación de glutamato 30 μM. Los tamaños de muestra (n) probados de concentraciones bajas a altas son 4, 5, 5, 5, 12 y 5 células. En las figuras, e, fyh, todos los experimentos se ejecutaron a 0 mV y los datos se presentaron como valores medios ± SD.

En comparación con el hEAAT3 que mira hacia adentro en el estado apo (PDB ID: 6X3F)20, encontramos que el HP2 en el complejo hEAAT2Glu se desplaza notablemente hacia el lado intracelular cuando se une el glutamato (Fig. 2g), lo que evitaría el escape del sustrato. Esta conformación está estabilizada por enlaces de hidrógeno entre HP2 y las hélices circundantes. Además de participar directamente en la unión del glutamato, D475TM8 también puede formar un enlace de hidrógeno con el nitrógeno de la columna vertebral de S444HP2 de HP2, lo que contribuye al acercamiento de la punta de HP2 (Fig. 2g). Además, el grupo carbonilo de la columna vertebral y la cadena lateral de S441HP2 interactúan con las cadenas laterales de S363HP1 y A394TM7, respectivamente (Fig. 2g). En conjunto, tres pares de enlaces de hidrógeno, incluidos D475-S444, S363-S441 y S441-A394, son fundamentales para mantener HP1 y HP2 cerca uno del otro. Curiosamente, el S441HP2 solo está presente en el hEAAT2 y está sustituido por un residuo de glicina conservado en la posición correspondiente de cada homólogo (Fig. 8 complementaria). Para investigar el papel funcional de S441HP2, sustituimos este residuo con glicina (S441GHP2) y realizamos registros electrofisiológicos mediante aplicaciones de varias concentraciones de glutamato. Sorprendentemente, encontramos que el mutante S441GHP2 muestra una mayor sensibilidad al glutamato con la Km a 0,40 ± 0,03 μM (Fig. 2h y Fig. 7d complementaria), que aumenta ~ 77 veces más que la de hEAAT2 de tipo salvaje, aunque el S441HP2 no está directamente involucrado en la unión del glutamato (Fig. 2c, d). Este residuo está presente exclusivamente en hEAAT2, en comparación con la glicina conservada en la posición correspondiente en otros homólogos (Fig. 8 complementaria). Especulamos que el residuo único S441HP2 probablemente proporcione interacciones adicionales para estabilizar HP2 en una confirmación sellada y prohibir la liberación de glutamato desde el lado intracelular. Por lo tanto, la mutación en S441HP2 podría romper estas interacciones, facilitar la liberación de glutamato, acelerar el ciclo de absorción de glutamato y, en consecuencia, sesgar el hEAAT2 hacia un canal con mayor probabilidad de apertura. La Ki aparente de WAY-213613 para el mutante S441GHP2 se redujo a 0,26 μM (Fig. 2f y Fig. 7g complementaria), lo que sugiere que este sitio también afecta la unión del inhibidor de cierta manera.

El WAY-213613 muestra una alta selectividad por el hEAAT2, por lo que es deseable investigar sus diferencias de especificidad entre los hEAAT. Para investigar el mecanismo inhibitorio de hEAAT2 por WAY-213613, determinamos una estructura compleja de hEAAT2 con este inhibidor a una resolución de 3.4 Å (Fig. 3a y Fig. 3 complementaria). El WAY-213613 está compuesto por tres grupos funcionales, incluidos los grupos bromofluorofenol, anilina y asparagina (Fig. 3b). Esta estructura compleja adopta una conformación orientada hacia el interior. Se identifica una densidad adicional en el sitio de unión del glutamato cerca del lado citoplásmico de la membrana, que es muy compatible con el inhibidor WAY-213613 (Fig. 3b). De aquí en adelante, denominamos al hEAAT2 unido a WAY-213613 como complejo hEAAT2W. Las interacciones involucradas en la estabilización del inhibidor WAY-213613 se componen de interacciones hidrofóbicas y enlaces de hidrógeno entre el inhibidor y los residuos que lo rodean (Fig. 3c, d). Más específicamente, el grupo α-carboxilo de WAY-213613 forma contactos con el nitrógeno principal y el grupo hidroxilo de la cadena lateral de S364HP1. El grupo amino de WAY-213613 está coordinado con el grupo carboxilo de cadena lateral de D475TM8 (Fig. 3c). Además, R478TM8 no solo forma un puente salino con D475TM8, sino que también forma dos interacciones catión-π con Y404TM7 y el grupo anilina de WAY-213613 (Fig. 3c). Estas observaciones estructurales también están respaldadas por el análisis funcional de que los mutantes D475ATM8 y R478ATM8 exhibieron afinidades de unión significativamente reducidas con WAY-213613 en comparación con hEAAT2 de tipo salvaje (Fig. 2f). Además, el grupo bromofluorofenol está envuelto en una cavidad hidrofóbica formada por los residuos hidrofóbicos I464TM8, L467TM8, V468TM8, M450HP2 y L447HP2 (Fig. 3c). El grupo bromofluorofenol también se estabiliza al formar una interacción de pila π−π con Y404TM7 en una configuración en forma de T (Fig. 3c). En el mapa crio-EM del complejo hEAAT2W, se encontró que una molécula similar a DDM estaba intercalada entre TM1 y la hélice desenrollada de TM8. Su cola hidrofóbica apunta hacia el lado extracelular. El grupo de cabeza se coloca próximo al grupo bromofluorofenol y forma interacciones hidrofóbicas para estabilizar la unión de WAY-213613 (Figura complementaria 4b, e). Por lo tanto, especulamos que una molécula lipídica en el entorno de la membrana puede ocupar la posición de unión del DDM y participar en los efectos inhibidores del transporte de glutamato por parte de WAY-213613.

a Estructura general de hEAAT2W vista desde el plano de la membrana. WAY-213613 se muestra como esferas. b Corte a través de la superficie molecular del protómero único de hEAAT2W. El WAY-213613 se muestra en barras y su densidad EM correspondiente se muestra en malla azul. c Sitio de enlace detallado para WAY-213613 en hEAAT2W. El inhibidor WAY-213613 (rosa) y los residuos de interacción clave se muestran como barras; los residuos hidrofóbicos del bolsillo de unión se muestran como esferas semitransparentes. d Gráfica 2D que representa las interacciones de WAY-213613 con sus residuos circundantes por LigPlot+. e Cambios conformacionales del sitio de unión del glutamato entre hEAAT2W (verde pálido) y hEAAT2Glu (gris). El HP2 de hEAAT2W está resaltado en rojo y las flechas negras indican el cambio del HP2.

También superpusimos las estructuras de hEAAT2Glu y hEAAT2W (Fig. 3e). Dado que una parte de WAY-213613 se deriva de la asparagina, no fue sorprendente que el inhibidor forme interacciones de enlace de hidrógeno similares en paralelo con la situación de unión de glutamato. Los grupos α-carboxilo y α-amino de WAY-213613 o glutamato están coordinados por el mismo grupo de residuos de TM8 y la punta de HP1, como D475TM8 y S364HP1 (Figs. 2c, 3c). Sin embargo, tras la unión de WAY-213613, el grupo hidrofóbico bromofluorofenol del inhibidor interactúa con los residuos hidrofóbicos del HP2, como M450HP2 y L447HP2, y en consecuencia aleja el HP2 de la punta HP1 y abre la punta HP2. La espiral HP2b experimenta una rotación hacia afuera con un ángulo de aproximadamente 22°, y la punta HP2 tiene un cambio de distancia de ~8,0 Å (Fig. 3e). Solo debido al movimiento de HP2, los residuos S441HP2 y S444HP2 en la punta de HP2 no pueden formar enlaces de hidrógeno con la punta de HP1 y TM8, respectivamente, que está presente en la estructura hEAAT2 unida al glutamato (Fig. 2g). En cambio, el grupo hidroxi S441HP2 forma un enlace de hidrógeno con el grupo carbonilo de T395TM7 y, por lo tanto, estabilizó el estado de unión de WAY-213613 (Fig. 3c), en línea con el análisis funcional mencionado anteriormente de que la mutación S441GHP2 disminuyó la sensibilidad de hEAAT2 a WAY-213613 (Figura 2f). Como los residuos que participan en la unión de WAY-213613 son de elementos HP1, HP2 y TM8, esta red de interacción mediada por WAY-213613 podría, en consecuencia, estabilizar el hEAAT2 en un estado de conformación orientado hacia adentro. Además, una conformación tan abierta de HP2 estabilizada por WAY-213613 dificulta el cambio conformacional, un proceso clave para la actividad de hEAAT2.

Para comprender cómo WAY-213613 bloquea selectivamente el hEAAT2, superpusimos la estructura del hEAAT3Na que mira hacia adentro (PDB ID: 6X2L)20 con la del hEAAT2W (Fig. 4a-c). Descubrimos que el grupo de asparagina de WAY-213613 es bastante compatible con la estructura de hEAAT3. Sin embargo, algunos residuos adyacentes a los grupos bromofluorofenol están sustituidos en hEAAT3. En particular, los residuos V468TM8, L467TM8 e I464TM8 de TM8 de hEAAT2 se sustituyen por I437TM8, I436TM8 y V433TM8 en hEAAT3, respectivamente (Fig. 4c y Fig. 8 complementaria). En consecuencia, estas sustituciones en hEAAT3 conducen a la contracción del bolsillo de unión de WAY-213613 en hEAAT3, lo que implica el mecanismo por el cual hEAAT3 no puede exhibir la misma alta afinidad por el inhibidor WAY-213613 que hEAAT2 (Fig. 4a, b) . Para validar las hipótesis anteriores, diseñamos tres mutaciones, incluidas I464VTM8, L467ITM8 y V468ITM8. Los experimentos electrofisiológicos indican que las mutaciones no afectan la unión del glutamato. Para estos tres mutantes, la aplicación de glutamato en la solución externa puede activar significativamente la corriente de aniones con una eficacia similar a la de hEAAT2 de tipo salvaje (Fig. 4d y Fig. 9a-c complementaria). Sin embargo, estas mutaciones conducen a una disminución significativa en la sensibilidad a WAY-213613, con Ki aumentado a ~ 0.17 μM, ~ 0.46 μM y ~ 0.20 μΜ para los mutantes I464VTM8, L467ITM8 y V468ITM8, respectivamente (Fig. 4e y Fig. complementaria). 9d–f), lo que respalda nuestras especulaciones de que los residuos I464TM8, L464TM8 y V468TM8 son cruciales para la especificidad de unión de hEAAT2 con WAY-213613.

a Representación de superficie del bolsillo WAY-213613 en el hEAAT2W (verde pálido). El WAY-213613 se muestra en palos (rosa). b Acoplamiento de WAY-213613 en el hEAAT3Na (ID de PDB: 6X2L). La representación de superficie de hEAAT3Na (azul) indica una contracción del bolsillo de unión WAY-213613 en hEAAT3. El WAY-213613 se muestra en palos (rosa). c Comparación estructural del dominio de transporte de hEAAT2W (verde pálido) y hEAAT3Na (PDB ID: 6X2L, gris). WAY-213613 y los residuos hidrofóbicos en su bolsillo de unión se muestran en barras. El HP2 de hEAAT2W está coloreado en rojo. d Relaciones dosis-respuesta de glutamato para las corrientes mediadas por I464VTM8, L467ITM8 o V468ITM8. Las relaciones dosis-respuesta para los mutantes probados se analizaron en las concentraciones variadas de glutamato indicadas en la Fig. 1a. Los tamaños de muestra (n) probados de concentraciones bajas a altas se enumeran a continuación: n = 5, 5, 5, 5, 5 y 5 células para el mutante I464VTM8; n = 4, 4, 5, 5, 5 y 5 células para el mutante L467ITM8; n = 5, 5, 5, 5, 4 y 6 células para el mutante V468ITM8. e WAY-213613 relaciones dosis-respuesta para las corrientes mediadas por I464VTM8, L467ITM8 o V468ITM8. Las relaciones dosis-respuesta para los mutantes hEAAT2 como WAY-213613 variaron en las concentraciones indicadas en la Fig. 1b. Las líneas representan los mejores ajustes a una ecuación similar a Michaelis-Menten con Ki aparente de 0,166 μM, 0,464 μM y 0,196 μM, respectivamente. Las corrientes se normalizaron a la corriente máxima registrada después de la aplicación de 30 μM WAY-213613. Los tamaños de muestra (n) probados de concentraciones bajas a altas son: n = 5, 5, 5, 4, 4, 5 y 10 células para I464VTM8; n = 5, 5, 5, 5, 5, 4 y 11 celdas para L467ITM8; n = 5, 5, 5, 5, 5, 5 y 11 celdas para V468ITM8. Los datos de hEAAT2 de tipo salvaje de la Fig. 1b se compararon con los de los mutantes probados. En higos. d y e, todos los experimentos se ejecutaron a 0 mV y los datos se presentaron como valores medios ± SD.

Hasta el momento, se han determinado una serie de estructuras de los homólogos de hEAAT2 en presencia de los diferentes tipos de inhibidores, incluidos los inhibidores competitivos TBOA10,14,18, TFB-TBOA14,19,35, los isómeros trans y cis de p-OMe-azo -TBOA36, Lc-BPE25 e inhibidores alostéricos UCPH-10119. Se adoptaron estructuras complejas con conformación orientada hacia adentro para una mayor comparación con hEAAT2W (Fig. 10a complementaria), que comprenden GltPhTFB-TBOA (ID de PDB: 6 × 14) 14, GltPhTBOA (ID de PDB: 6 × 16) 14 y hEAAT3TFB-TBOA (Identificación de PDB: 6S3Q)35. En las estructuras de GltPhTBOA y hEAAT3TFB-TBOA, los inhibidores se insertan en las dos hélices de HP2 para separar HP2a de HP2b y, por lo tanto, bloquean el cambio conformacional del transportador (Fig. 10b, c complementarias). Sin embargo, la orientación de WAY-213613 en el complejo hEAAT2W es significativamente diferente de la de los inhibidores en los complejos GltPhTBOA y hEAAT3TFB-TBOA (Fig. 10a-c complementaria). El grupo bromofluorofenol de WAY-213613 está ubicado en la "cavidad hidrofóbica profunda" formada por TM8, TM7b y HP2b (Fig. 3c y Fig. 10a complementaria). El complejo GltPhTFB-TBOA muestra un sitio de unión distinto al del complejo hEAAT3TFB-TBOA (Figuras complementarias 10c, d). Por el contrario, el complejo GltPhTFB-TBOA parece mostrar un sitio de unión similar al del complejo hEAAT2W (Figuras complementarias 10a, d). Sin embargo, el TFB-TBOA no puede acercarse a la "cavidad profunda" del WAY-213613 en el hEAAT2 (Fig. 10e complementaria). Los resultados anteriores revelan que el WAY-213613 está unido a una cavidad previamente no identificada.

hEAAT2 es el transportador de aminoácidos excitatorios expresado más abundantemente en los astrocitos, que está obligado a la captación de glutamato desde la hendidura sináptica hacia los astrocitos para prevenir la citotoxicidad neuronal3. Aquí, informamos la estructura crio-EM de hEAAT2Glu en complejo con glutamato, que revela los detalles moleculares de cómo hEAAT2 reconoce el glutamato. En comparación con los homólogos eucarióticos (hEAAT119, hEAAT320, hASCT222) y los homólogos procarióticos (GltPh14, GltTk17) (Fig. 6 complementaria), los residuos de interacción clave involucrados en la unión del sustrato están altamente conservados entre hEAAT2 y los homólogos mencionados anteriormente. Mientras tanto, encontramos que un residuo único S441HP2 está presente exclusivamente en hEAAT2 y se sustituye por la glicina conservada en la posición correspondiente de otros homólogos (Fig. 8 complementaria). Los experimentos electrofisiológicos mostraron que la afinidad de S441GHP2 por el glutamato puede aumentar significativamente en comparación con la de hEAAT2 de tipo salvaje (Fig. 2h). En particular, el S441HP2 está ubicado en la punta HP2 y no participa directamente en la interacción con el glutamato (Fig. 2g). Por lo tanto, especulamos que S441HP2 puede afectar la tasa de transporte de glutamato. Se requerirán más experimentos para aclarar los roles funcionales de S441HP2 en hEAAT2.

En este estudio, también resolvimos la estructura de hEAAT2 en complejo con el inhibidor WAY-213613, lo que aclara claramente el bolsillo de unión de hEAAT2 para WAY-213613. El complejo hEAAT2W se estabiliza en el estado conformacional orientado hacia adentro. Los grupos α-carboxilo y α-amino y anilina de WAY-213613 forman contactos con los residuos S364HP1, D475TM8 y R478TM8 y comparten un sitio de unión superpuesto con el sustrato glutamato, de acuerdo con la noción de que WAY-213613 es un inhibidor competitivo. . En el complejo hEAAT2W, el HP2 sufre un cambio conformacional notable y gira alejándose del HP1, creando así suficiente espacio para la unión WAY-213613. Curiosamente, se determinó que S441HP2 formaba un enlace de hidrógeno con T395TM7 y, en consecuencia, estabilizaba HP2 en una conformación abierta, lo que resulta que esta interacción es fundamental para la unión de WAY-213613 (Figs. 3c, 2f). Mientras tanto, el grupo bromofluorofenol de WAY-213613 está envuelto por algunos residuos hidrofóbicos de TM8, TM7b y HP2b, como I464TM8, L467TM8, V468TM8, M450HP2 y L447HP2 (Fig. 3c). Según la comparación estructural y la alineación de secuencias, los residuos I464TM8, L467TM8 y V468TM8 de TM8 en hEAAT2 varían en comparación con los residuos correspondientes de otros hEAAT (Fig. 4c). Los experimentos electrofisiológicos demuestran que los tres residuos anteriores son críticos para la inhibición de hEAAT2 por WAY-213613 con alta potencia y la mutación en cada uno de los tres residuos reduce sustancialmente la eficiencia inhibidora de hEAAT2 por WAY-213613 (Fig. 4e). Teniendo en cuenta que el grupo I464-L467-V468 en hEAAT2 se sustituye por Val-Leu-Ile en hEAAT3 o Ile-Ile-Val en hEAAT1/hEAAT4/hEAAT5, respectivamente, especulamos que el grupo I464-L467-V468 de TM8 actúa como un determinante estructural clave para la inhibición selectiva de hEAAT2 por WAY-213613.

El gen hEAAT2 de longitud completa (acceso UniProtKB: P43004) se clonó a partir de un ADNc de HEK293 y se construyó en un vector pEG BacMam modificado que tiene un Strep∙ Tag II N-terminal seguido de una supercarpeta GFP (sfGFP) y una proteasa PreScission ( PPase) sitio de reconocimiento. Se usó el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) para expresar proteínas recombinantes hEAAT2 en células HEK293F. Brevemente, el plásmido pEG-strep-GFP-hEAAT2 se transformó en células de Escherichia coli DH10bac para adquirir un plásmido bácmido que contenía el gen hEAAT2, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bac-to-Bac; Invitrogen). Luego se obtuvo el baculovirus en células Sf9 (células de Spodoptera frugiperda-9), y se recolectaron los virus P2 a las 72 h de amplificación. Se cultivaron células HEK 293F a una densidad de 2,5 × 106 células/ml a 37 °C, y se añadieron los virus P2 en una proporción del 1 % (v/v) para iniciar la transfección y, simultáneamente, se suplementaron con glutamato 1 mM (Sigma- Aldrich) o WAY-213613 5 μM (MedChemExpress) y FBS (suero fetal bovino) al 1 % (v/v), luego se incuba en un agitador a 37 °C con 5 % de CO2. Después del cultivo de 8 a 12 h, se agregó butirato de sodio 10 mM y las células continuaron incubadas durante 48 h, seguidas de centrifugación a 2500 × g durante 5 min a 4 ° C para la recolección de células.

Los sedimentos de células se resuspendieron en tampón A (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, glutamato 1 mM o WAY-213613 5 μM) complementado con una dilución 1:1000 de cóctel inhibidor de proteasa de mamífero (Sigma- Aldrich) o ultracongelado con nitrógeno líquido y almacenado a -80 °C para su uso posterior. Las células resuspendidas se rompieron en un homogeneizador Dounce. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 10 000 × g durante 10 min a 4 °C, y el sobrenadante se ultracentrifugó a 100 000 × g durante 0,5 h a 4 °C. Los sedimentos de membrana crudos se resuspendieron en tampón A suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasa y se homogeneizaron. Se añadió n-dodecil-β-d-maltopiranósido al 1 % (p/v) (DDM; Anatrace) y hemisuccinato de colesterilo al 0,2 % (p/v) (CHS; Sigma-Aldrich) a la solución homogénea, seguido de una solubilización de 2 h. con agitación suave a 4 °C. Después de la ultracentrifugación a 100 000 × g durante 0,5 h a 4 °C, se eliminaron los residuos insolubles y el material solubilizado se filtró a través de un filtro de 0,22 μM (Merck Millipore). Posteriormente, el filtrado pasó lentamente a través de una columna Streptactin Beads (Smart-Lifesciences) preequilibrada con el tampón B (tampón A suplementado con 0,025 % (p/v) de DDM y 0,005 % (p/v) de CHS) a una velocidad de ~0,2 ml/min. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón B para eliminar los materiales no unidos y la proteína se eluyó con cuatro volúmenes de columna de tampón C (tampón B complementado con d-destiobiotina 5 mM). Strep∙Tag II N-terminal y GFP se digirieron incubando con una proporción adecuada de proteasa PreScission casera a 4 °C durante 3 h. La muestra de hEAAT2 se concentró a 1 ml usando un concentrador de corte de 100 kDa (Merck Millipore) y se purificó más por cromatografía de exclusión por tamaño usando Superose 6 Increment 10/300 GL (GE Healthcare) preequilibrado con el tampón B. Finalmente, las fracciones que contenían proteína purificada se recogieron e inmediatamente se concentraron para la preparación de rejilla crio-EM.

Para preparar rejillas para imágenes crio-EM, la proteína recién purificada se concentró y se complementó con glutamato 2 mM o WAY-213613 200 μM en hielo y se incubó durante 30 min. En total, se aplicaron 2,5 μl de 12,6 mg/ml de complejo hEAAT2Glu o 10 mg/ml de complejo hEAAT2W a rejillas crio-EM de carbono perforado (Quantifoil Cu R1.2/1.3, malla 300), que se sometieron a descarga luminiscente durante 60 s. en condiciones de H2O2 por el limpiador de plasma Solarus (Gatan). Las rejillas se secaron durante 2,5 s a 4 °C y 100 % de humedad en Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific), posteriormente se vitrificaron por inmersión en etano líquido y se almacenaron en nitrógeno líquido. Los datos de Cryo-EM se adquirieron utilizando un microscopio electrónico de transmisión Titan Krios de 300 kV (Thermo Fisher Scientific) equipado con un detector de electrones directo Gatan K2 Summit (Gatan) colocado después de un filtro de energía cuántica GIF. Con la rendija del filtro de energía configurada en 20 eV, SerialEM37 se usó para la recolección de pilas de películas por robot en modo de conteo de súper resolución con un aumento de ×130 000 (tamaño de píxel de 1,04 Å) con un rango de desenfoque nominal de 1,5 a 2,5 μm. Las pilas de películas tenían una dosis total de alrededor de 50 e/Å2 distribuida en 60 fotogramas con un rango de tasa de dosis de 8,5 a 9,0 e−/Å2/s.

Para el conjunto de datos del complejo hEAAT2Glu, se recopilaron un total de 2256 películas fraccionadas por dosis, el movimiento inducido por el haz se corrigió mediante MotionCor238 y la estimación de la función de transferencia de contraste (CTF) se determinó mediante GCTF39. Se descartaron 148 imágenes que revelaron una mala estimación de CTF o que mostraban contaminación con hielo, lo que dio como resultado 2108 imágenes que se seleccionaron para un análisis posterior con RELION-3.140, a menos que se mencione específicamente. Se seleccionaron automáticamente un total de 1 509 287 partículas con Gautotch y las referencias iniciales se calcularon con Ab-initio Reconstruction en cryoSPARC41. Se realizaron dos rondas de clasificación 3D multirreferencial guiada contra varios mapas sesgados y resultando buenas referencias en las que se impuso la simetría C3. La clase 4 resultante (41,8 %) en la primera ronda de clasificación 3D y la clase 4 (82,8 %) en la segunda ronda de clasificación 3D mostraron hélices transmembrana claramente resueltas y se sometieron al siguiente refinamiento 3D, que arrojó un 3,9 Å mapa de resolucion Para mejorar aún más la calidad del mapa hEAAT2, se realizaron clasificaciones 3D sin alineación con el uso de una máscara ajustada y se impuso la simetría C3. Las partículas que componen la mejor clase de 6 clases (15,0 %) se seleccionaron para un mayor refinamiento CTF y un refinamiento automático 3D utilizando simetría C3 y posprocesamiento con máscara ajustada, y mejoraron el mapa final a una resolución de 3,4 Å de acuerdo con el criterio GSFSC42 informado.

Para el conjunto de datos del complejo hEAAT2W, se recopilaron un total de 465 películas fraccionadas por dosis, el movimiento inducido por el haz se corrigió mediante MotionCor238 y la estimación de CTF se determinó mediante GCTF39. Se seleccionaron un total de 233 008 partículas de las 420 micrografías utilizando el selector de plantillas en cryoSPARC41. Las partículas extraídas se sometieron a dos rondas de clasificación 2D. Se seleccionaron los buenos promedios de clase 2D y se sometieron a Refinamiento Heterogéneo 3D con simetría C3 impuesta. La buena clase 3D resultante con 98 685 partículas se sometió a Refinamiento no uniforme 3D para producir un mapa con una resolución de 3,7 Å. Las 98 685 partículas se volvieron a extraer en RELION-3.140, seguidas de un refinamiento automático en 3D, posprocesamiento y pulido para mejorar aún más la calidad de las partículas, y luego las partículas pulidas se reimportaron a cryoSPARC. Después del refinamiento heterogéneo 3D con simetría C3 impuesta, 98 536 partículas de la mejor clase se sometieron a un refinamiento no uniforme. Finalmente, se obtuvo un mapa con una resolución de 3,4 Å.

Para la construcción del modelo del complejo hEAAT2Glu, se utilizó una estructura crio-EM lanzada anteriormente de hEAAT3 (ID de PDB: 6S3Q)35 que eliminaba sus componentes no proteicos como modelo de referencia acoplado al mapa de densidad usando Chimera43, seguido de un ajuste manual en COOT44. Este mapa de alta resolución puede asignar de manera visible la secuencia de la proteína y modelar con confianza la mayoría de los residuos (37–148, 162–195 y 229–507). Se encontró una densidad sólida huérfana en cada protómero en el centro espacial que cubre la parte superior de HP2 y HP1, que se consideró que era una densidad de glutamato 2 mM preexistente cuando se prepararon las rejillas y se unió a un sitio similar el aspartato o la glutamina del sustrato análogo. en homólogos de hEAAT2. La molécula de glutamato se acopló manualmente a la densidad usando COOT. Las restricciones para PC1 (1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfocolina) y CHS se derivaron de eLBOW45 en Phenix. Aquí se usó PC1 como lípido modelo con la eliminación de cadenas de acilo o cabezas de etanolamina para adaptarse a las densidades correspondientes. Posteriormente, el modelo se sometió a un ajuste manual en COOT y se refinó contra el mapa utilizando Phenix con rondas de refinamiento en espacio real46 con parámetros predeterminados. Se utilizó MolProbity47 para la validación. El modelo final de hEAAT2 obtuvo una buena geometría (Tabla complementaria 1). Se calcularon las curvas de correlación de Fourier Shell (FSC) entre el modelo desenmascarado refinado final y el mapa enmascarado, así como la validación cruzada del modelo refinado frente al mapa de hEAAT2 (Figura 2 complementaria y Tabla complementaria 1). Las figuras se prepararon utilizando UCSF ChimeraX48 y PyMOL49 o LigPlot+50.

Se cultivaron células de riñón embrionario humano 293T (HEK293T) en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 15 % (v/v) (FBS, PAN-Biotech) a 37 °C con 5 % de CO2. Las células HEK293T se cultivaron en las placas de cultivo (d = 3,5 cm) (Thermo Fisher Scientific) durante 24 h y luego se usó 1 μg de plásmidos mutantes y de tipo salvaje de hEAAT2 por placas para transfectar transitoriamente HEK293T usando 0,7 μg de reactivo Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific). Las células se analizaron mediante experimentos electrofisiológicos entre 24 y 40 h después de la transfección a temperatura ambiente (21–25 °C).

Los experimentos electrofisiológicos se realizaron como se describió anteriormente con una modificación menor25. El tampón externo contenía NaCl 140 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2 mM y HEPES 10 mM (pH = 7,4 con NaOH y osmolaridad de ~310 mosmol L-1) y mientras que la solución de pipeta interna estaba compuesta por NaSCN 130 mM, MgCl2 2 mM, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM (pH = 7,4 con NaOH y osmolaridad de ~310 mosmol L−1) y glutamato 10 mM. Se prepararon soluciones madre de WAY-213613 50 mM en sulfóxido de dimetilo (DMSO), seguido de diluciones a las concentraciones de trabajo con el tampón externo mencionado anteriormente. En nuestro experimento se usó el máximo de DMSO al 0,5 % y no afectó los resultados electrofisiológicos en las células de control. Las grabaciones del experimento de pinzamiento de parche de células completas se realizaron a partir de células HEK293T positivas para GFP aisladas (hEAAT2 de tipo salvaje y mutantes). En total, se utilizaron de 3 a 6 MΩ para disparar una pipeta pulida (Sutter Instrument). Debido a que la corriente relativamente pequeña y la compensación no tuvieron efecto sobre la magnitud de las corrientes observadas, la resistencia en serie no se compensó en estos experimentos. Las células se sumergieron en el tampón externo mencionado anteriormente complementado con una concentración específica de glutamato o WAY-213613. La corriente de anión inducida por glutamato, la corriente de fuga de anión dependiente de Na+ y la corriente de transporte de glutamato o las corrientes de fuga de anión inhibidas por WAY-213613 se registraron utilizando un amplificador EPC-10 (HEKA Electronic) a una frecuencia de muestreo de 20 kHz con filtro de paso bajo a 5 kHz. Todos los experimentos se ejecutaron a 0 mV. Después de estabilizar la corriente celular, se mantuvo el glutamato o WAY-213613 en las concentraciones indicadas desde la dosificación externa durante al menos 6 s. Posteriormente, la célula se lavó con tampón externo para iniciar una nueva ronda de aplicaciones o finalizar el experimento. Las corrientes de meseta se utilizaron para los siguientes cálculos. Para el análisis, los datos fueron adquiridos por el programa PatchMaster (HEKA Electronic) a los 5 s después de la grabación. Las relaciones dosis-respuesta no lineales se ajustaron en una ecuación similar a Michaelis-Menten que se muestra a continuación para obtener los valores aparentes de Km y Ki en presencia de glutamato o WAY-213613.

En esta ecuación, represento la corriente a diferentes concentraciones de glutamato o inhibidor, e Imax representa la corriente máxima a la concentración de saturación de glutamato o inhibidor. [C] representa la concentración de glutamato o inhibidor. Km/i representa la constante aparente.

La significación estadística se evaluó usando ANOVA unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Bonferroni descrita detalladamente como en las leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los mapas tridimensionales de densidad crio-EM de hEAAT2Glu y hEAAT2W se han depositado en la base de datos de EM con los códigos de acceso EMD-33407 y EMD-33408, respectivamente, y las coordenadas de las estructuras se han depositado en el banco de datos de proteínas con el código de acceso códigos 7XR4 y 7XR6, respectivamente. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a B. Zhu y a otros miembros del personal del Centro de Imágenes Biológicas (CBI), Instalaciones Básicas para la Ciencia de Proteínas del Instituto de Biofísica, Academia China de Ciencias (IBP, CAS) por el apoyo en la recopilación de datos crio-EM; Agradecemos a Bei Yang y Yan Wu por su servicio de asistente de investigación. Este trabajo está financiado por los Programas Nacionales Chinos para la Ciencia del Cerebro y la Tecnología de Inteligencia Similar al Cerebro (Subvención No. 2022ZD0205800 a YZ), el Programa de Investigación Prioritaria Estratégica de la Academia China de Ciencias (Subvención No. XDB37030304 a YZ), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (Subvención No. 2021YFA1301501 a YZ), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 92157102 a YZ y Subvención No. 32070031, 31770051 a JJ), el Laboratorio Nacional de Biomacromoléculas, Instituto de Biofísica, Academia de Ciencias de China ( Subvención No. 2021kf10 y 2022kf09), Programas Nacionales Chinos para la Ciencia del Cerebro y Tecnología de Inteligencia Similar al Cerebro (Subvención No. 2021ZD0202102 a ZH), y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 81371432 a ZH).

Estos autores contribuyeron por igual: Zhenglai Zhang, Huiwen Chen, Ze Geng.

Departamento de Microbiología y Biotecnología, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Agrícola del Noreste, No. 600 Changjiang Road, Xiangfang District, Harbin, 150030, China

Zhenglai Zhang, Huiwen Chen y Juquan Jiang

Laboratorio Nacional de Biomacromoléculas, Centro CAS para la Excelencia en Biomacromoléculas, Instituto de Biofísica, Academia China de Ciencias, Beijing, 100101, China

Zhenglai Zhang, Huiwen Chen, Zhuoya Yu, Hang Li, Yanli Dong, Hongwei Zhang y Yan Zhao

Laboratorio Estatal Clave de Medicamentos Naturales y Biomiméticos, Departamento de Farmacología Molecular y Celular, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín, Beijing, 100191, China

Ze Geng y Zhuo Huang

Instituto IDG/McGovern para la Investigación del Cerebro, Universidad de Pekín, Pekín, 100871, China

Ze Geng y Zhuo Huang

State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science, Instituto de Biofísica, Academia China de Ciencias, 15 Datun Road, Beijing, 100101, China

Zhuoya Yu y Yan Zhao

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de la Academia China de Ciencias, Beijing, 100049, China

Zhuoya Yu, Hang Li, Hongwei Zhang y Yan Zhao

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YZ concibió el proyecto y supervisó la investigación. ZZ preparó una muestra para el estudio crio-EM. HC y ZY recopilaron datos crio-EM y calcularon los mapas EM. ZZ y ZY construyeron y refinaron el modelo atómico. HL, YD y HZ ayudan a purificar la muestra de proteína. YZ, JJ y ZZ analizaron la estructura. ZH y YZ diseñado y ZG realizó los experimentos electrofisiológicos. ZZ, HC y ZY contribuyeron al borrador inicial del manuscrito. YZ y JJ editaron el manuscrito con aportes de todos los autores en la versión final.

Correspondencia a Zhuo Huang, Juquan Jiang o Yan Zhao.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Rosemary Cater, Josep Font Sadurni y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Zhang, Z., Chen, H., Geng, Z. et al. Base estructural de los modos de unión de ligandos de EAAT2 humana. Nat Comun 13, 3329 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31031-x

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Recibido: 08 noviembre 2021

Aceptado: 31 de mayo de 2022

Publicado: 09 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31031-x

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