De un genoma - Grupo Co., Ltd de los laboratorios de minería de Foshan

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 277 (2023) Citar este artículo

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Ampliar el arsenal de enfoques profilácticos contra el SARS-CoV-2 es de suma importancia, específicamente aquellas estrategias que son resistentes a la deriva antigénica en Spike. Aquí, realizamos una pantalla de más de 16,000 desencadenantes de ARNi contra el genoma del SARS-CoV-2, utilizando un ensayo paralelo masivo para identificar siRNA hiperpotentes. Seleccionamos diez candidatos para la validación in vitro y encontramos cinco siRNA que exhibieron actividad hiperpotente (IC50 < 20 pM) y un fuerte bloqueo de la infectividad en experimentos con virus vivos. Mejoramos aún más esta actividad mediante el emparejamiento combinatorio de los candidatos de siRNA e identificamos cócteles que eran activos contra múltiples tipos de variantes de preocupación (VOC). A continuación, examinamos más de 2000 posibles mutaciones en los sitios diana del siRNA mediante el uso de mutagénesis de saturación y confirmamos una amplia protección del cóctel líder frente a futuras variantes. Finalmente, demostramos que la administración intranasal de este cóctel de siRNA atenúa efectivamente los signos clínicos y las medidas virales de la enfermedad en el modelo de hámster sirio estándar. Nuestros resultados allanan el camino para el desarrollo de una capa adicional de profilaxis antiviral que sea ortogonal a las vacunas y los anticuerpos monoclonales.

Covid-19 ha sido una de las peores pandemias del mundo en los tiempos modernos. Si bien las vacunas han sido un gran triunfo, existe una necesidad urgente de ampliar el arsenal de medidas preventivas para abordar algunas de sus deficiencias1. En primer lugar, prácticamente todas las vacunas autorizadas se dirigen a la proteína Spike2,3, convergiendo en un único punto de falla, dada la exposición a mutantes de escape y variantes virulentas emergentes4,5,6,7,8. Además, como todos los tratamientos con anticuerpos monoclonales (mAb) se dirigen a esta misma proteína, tales cambios antigénicos no solo dificultan la protección de las vacunas, sino que también pueden reducir la eficacia de una amplia gama de otros tipos de tratamiento. En segundo lugar, múltiples estudios han demostrado que la protección de las vacunas, incluso contra enfermedades graves, generalmente disminuye en unos pocos meses, después de la segunda9, tercera10,11 o cuarta dosis12. En tercer lugar, líneas de evidencia recientes derivadas de ratones y primates no humanos (NHP, por sus siglas en inglés) sugieren que las versiones actualizadas de las vacunas exhiben una eficacia disminuida y pueden estar sujetas al pecado antigénico original13,14, cuando la primera exposición a un virus determina el resultado de exposiciones posteriores a cepas relacionadas antigénicamente. Estos datos sugieren la utilidad limitada de las actualizaciones de vacunas para variantes emergentes de preocupación (VoC). En cuarto lugar, los medicamentos antivirales como Paxlovid no lograron proteger a los adultos de la exposición al COVID-19. Finalmente, varios estudios muestran consistentemente que es un desafío lograr una alta protección en personas inmunodeprimidas, incluso después de dosis repetidas15, lo que implica que las personas que más necesitan una vacuna son las que tienen menos probabilidades de beneficiarse de ella. Finalmente, las infecciones en personas inmunocomprometidas pueden tener una duración prolongada16,17, lo que aumenta el riesgo de hiperevolución y la aparición de VoC, lo que impone importantes riesgos para la salud pública.

Respaldados por el éxito de múltiples estudios previos en los que los ARN de interferencia pequeños (ARNip) se usaron eficazmente como antivirales18,19,20,21, imaginamos que los ARNip administrados por vía intranasal (in) serían particularmente adecuados como medida de aumento de vacunas para infecciones de el tracto respiratorio superior, donde pueden usarse para mitigar la transmisión.

Con este fin, examinamos más de 16 000 desencadenantes de interferencia de ARN (ARNi) que se dirigen al genoma del SARS-CoV-2 para identificar candidatos hiperpotentes. La pantalla se basó en un ensayo masivamente paralelo, Sens.AI, que emplea un sistema de biología sintética para recapitular la actividad silenciadora de cada candidato de siRNA contra el virus. En nuestros estudios anteriores22,23, utilizamos una versión anterior de Sens.AI para identificar siRNA hiperpotentes contra el VIH y el VHC. Sin embargo, el diseño anterior era ineficiente y su realización llevó más de 6 meses. En el nuevo diseño, inventamos un método más rápido que mejora la relación señal-ruido empleando aprendizaje estadístico en lugar de laboriosos pasos experimentales. Los extensos análisis computacionales y los experimentos in vitro dieron como resultado un cóctel de dos candidatos de siRNA hiperpotentes, que demostraron ser efectivos contra todas las cepas virales probadas. Finalmente. La administración intranasal de este cóctel de siRNA se confirmó como eficaz en el modelo de hámster sirio de SARS-CoV-2.

Analizamos el genoma del SARS-CoV-2 en una serie de objetivos potenciales de ARN de horquilla corta (ARNsh) (Figura 1 complementaria). Este proceso se llevó a cabo colocando mosaicos en el genoma con secuencias superpuestas de 50 nucleótidos de largo, cada una desplazada por un solo nucleótido de la otra. La región a la que apunta cada shRNA comprendía un tramo de 22 nucleótidos ubicado en el medio de la secuencia de 50 nucleótidos, y el resto de la secuencia flanqueante servía para preservar el contexto genómico. Luego, aplicamos múltiples filtros in silico para excluir las regiones objetivo con baja fidelidad de síntesis, aquellas que no superan un umbral mínimo de conservación en las cepas virales, aquellas que contienen atributos de secuencia que típicamente se asocian con una respuesta pobre de shRNA y aquellas que poseen regiones semilla que potencialmente pueden coincidir con una transcripción humana (Tabla complementaria 1). En total, este proceso recuperó 16 471 candidatos de shRNA dirigidos al genoma del SARS-CoV-2 y su cadena negativa subgenómica de ARN1. Finalmente, esta biblioteca se complementó con un conjunto de 1118 shRNA de control positivo y negativo que se habían informado en pantallas anteriores contra genes relacionados con el cáncer en el genoma del ratón22.

Sintetizamos estos 17.589 shRNA y sus correspondientes regiones diana de 50 nucleótidos utilizando un conjunto de oligonucleótidos de ADN (Twist Bioscience). Cada uno de estos oligos tenía 185 nucleótidos de largo y constaba de dos sitios de recocido de PCR, el shRNA basado en miR-30, una guía y su hebra pasajera según nuestro diseño, un espaciador que contenía sitios de clonación y una región de 50 nucleótidos que recapitulaba el sitio objetivo. con su contexto genómico (Fig. 1a). Utilizamos una serie de pasos de clonación para introducir un gen reportero de Venus en la región espaciadora, de modo que la 3'UTR de Venus incluía la región objetivo de 50 nucleótidos e insertaba toda esta construcción en nuestra biblioteca de retrovectores (Fig. 1b).

un diseño Oligo. Cada oligo tenía un activador de ARNi único en el contexto de una columna vertebral de miR-30 junto con un tramo de 50 nucleótidos que flanqueaba el sitio objetivo del ARNi viral; b Diseño de biblioteca. Cada plásmido contenía un activador de ARNi específico y su sitio objetivo coincidente en cis como parte de la 3'UTR de un reportero de Venus; c–e Esquema de una pantalla in vitro en células humanas: c Primero se apagó la maquinaria de ARNi. Las células Dicer-/- 293FT se infectaron con la biblioteca de plásmidos y se clasificaron según la alta expresión de Venus, que formó la lectura T0; d A continuación, se encendió la maquinaria de ARNi. Restauramos la maquinaria de RNAi por expresión ectópica de un Dicer desestabilizado (ddDicer); e La actividad de la maquinaria de ARNi se moduló cuantitativamente. Se sometieron dos réplicas biológicas a siete condiciones diferentes, diseñadas para titular la expresión de Dicer hacia abajo, mediante el tratamiento con un siRNA anti-Dicer, o hacia arriba, mediante el tratamiento con Shield-1. Tras la clasificación FACS, se recogieron células Venuslow y Venusdark, y se secuenciaron sus regiones de construcciones oligo; f La matriz de datos resultante de la pantalla. Cada fila representa una combinación específica de una condición de tratamiento (la columna de la izquierda) y una puerta FACS (indicada como D, para oscuro, y L, para bajo). Estos vectores de fila describen el enriquecimiento de cada disparador de ARNi probado (azul) en comparación con los controles negativos (resaltados en verde) y positivos (resaltados en rojo). La columna del área bajo la curva (AUC) se calculó en función de la capacidad para distinguir los controles positivos de los negativos; g Selección de las dos mejores condiciones. Se seleccionaron los vectores de dos filas con el AUC más alto. Se muestran las curvas de recuperación de precisión (izquierda) y características operativas del receptor (derecha) calculadas para los controles intrínsecos. La puntuación de pantalla de cada disparador de ARNi se calculó como el promedio de estos vectores de dos filas.

Nuestro procedimiento de selección constaba de dos pasos para reducir el efecto de la variación de posición que puede introducir la integración retrovectorial. Primero realizamos la pantalla en una línea celular Dicernull/null 293FT humana, diseñada a través de la eliminación de CAS9/CRISPR (Fig. 1c; Fig. Suplementaria 2a, b). La ausencia de Dicer impidió la maduración de los shRNA, desacoplando efectivamente entre la expresión de Venus y la potencia de cada shRNA codificado. En general, transducimos 1,2 millones de células Dicernull/null 293FT con retrovectores que codificaron nuestra biblioteca a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,8. Tres días después de la infección, clasificamos por FACS cuatro millones de células Venushigh Dicernull/null 293FT de un total de 50 millones de células. Estas células representan instancias de integración exitosa de construcciones en loci genómicos, lo que se reflejó en una expresión adecuada de Venus. Luego restauramos la expresión de Dicer mediante el uso de una construcción sintética y modulamos la expresión de DICER para acoplar entre la señal óptica y la potencia de cada shRNA (Fig. 1d). La construcción sintética fue una fusión entre Dicer humano y un dominio desestabilizador (ddDicer) que se basó en una proteína FKBP12 humana mutante, lo que nos permitió aumentar la actividad de Dicer mediante el uso de Shield-124. Además, empleamos un siRNA contra Dicer para inducir el efecto contrario, reduciendo su expresión. La idea principal detrás de estas diversas condiciones fue identificar un régimen en el que la maquinaria de ARNi permita que los shRNA hiperpotentes inhiban sus objetivos, pero sea demasiado débil para respaldar la actividad de los shRNA menos potentes.

En total, examinamos la biblioteca en ocho condiciones diferentes de expresión ddDicer (Fig. 1e). La primera condición, que asignamos como T0, carecía de ddDicer y reflejaba la abundancia relativa no manipulada de los diversos shRNA. Las otras condiciones contenían dosis aumentadas de Shield-1 (para inducir la activación de ddDicer) o un siRNA anti-Dicer (para inhibir Dicer). Aplicamos cada una de estas siete condiciones a dos réplicas biológicas. Luego, clasificamos las células en cada réplica en tres contenedores en función de su expresión de Venus: alto, bajo y oscuro, seguido de la secuenciación de los contenedores bajo y oscuro para descifrar el nivel y la identidad de los shRNA. También secuenciamos T0 shRNAs sin clasificar para representar la distribución de los shRNAs en la biblioteca inicial. En general, obtuvimos (2 [réplicas] × 2 [contenedores de clasificación] × 4 [niveles de expresión Dicer] + 1 [T0] =) 17 bibliotecas de secuenciación (Illumina MiSeq), cada una compuesta por lecturas de extremos emparejados de 150 pb. En total, obtuvimos 36 millones de lecturas en promedio para cada biblioteca. Analizamos la región de 50 pares de bases que correspondía al objetivo de estas bibliotecas, las anotamos en su shRNA y contamos la cantidad de apariciones únicas de cada shRNA en cada condición. Finalmente, usamos DESeq225 para medir el enriquecimiento del shRNA en cada condición versus T0 y promediamos las dos réplicas biológicas. Este proceso produjo una matriz de 8 por 17 589 (Fig. 1f), donde cada columna representaba un shRNA, para el cual cada fila representa uno de los tratamientos (siRNA o Shield-1, cada uno para uno de los dos contenedores de clasificación, bajo y oscuro ), y la estadística de enriquecimiento (la columna más a la derecha) se representó luego por el área bajo la curva (AUC) calculada por DESeq2.

Luego, usamos nuestros controles internos para identificar los parámetros óptimos que separan los shRNA hiperpotentes del resto de la biblioteca (Fig. 1f, g). Calculamos el AUC para distinguir los controles poco potentes de los hiperpotentes utilizando la estadística de enriquecimiento DESeq2. En general, este proceso mostró que los bins bajos de Venus superaron sustancialmente a los bins oscuros en términos de distinguir entre los controles hiperpotentes y los pobres. Además, las condiciones que contenían Shield1 funcionaron mejor que las condiciones sin Shield, siendo las concentraciones de 10 pM y 100 pM las de mejor desempeño. Por lo tanto, decidimos centrarnos en estas dos condiciones con la puerta de Venus baja como las condiciones óptimas para distinguir entre los nuevos shRNA hiperpotentes de los de bajo rendimiento. Después de centrarse en los disparadores de ARNi con alta cobertura de secuenciación, estas dos condiciones tenían puntuaciones de AUC cercanas al 80 % para los controles internos. Más importante aún, estas dos condiciones mostraron un valor predictivo positivo (PPV) perfecto para los controles internos al restringir el retiro al 5% superior de la lista.

Después de identificar los parámetros óptimos, clasificamos los shRNA candidatos del SARS-CoV-2 mediante un proceso similar al empleado para los controles internos. Para cada shRNA, usamos la estadística DESeq2 de cada una de las condiciones bajo las mismas restricciones de cobertura de secuenciación. El resultado final fue una lista ordenada por rango de shRNA en todas las condiciones probadas, con el shRNA más potente en la parte superior y el menos potente en la parte inferior.

A continuación, validamos la clasificación de nuestra pantalla utilizando varios métodos. En primer lugar, analizamos la correlación entre las pruebas estadísticas de ARNsh del SARS-CoV-2 en las dos condiciones de mayor rendimiento. Este análisis encontró que la correlación de Pearson entre las estadísticas informadas de las dos condiciones era del 72,2 % (p < 10−9), lo que indica que los resultados de la pantalla tenían una consistencia interna significativa (Fig. 2a). A continuación, nos centramos en las características de la secuencia de nuestros shRNA. Estudios previos informaron que los shRNA altamente potentes se asociaban típicamente con la ausencia de adenina en la posición 20 de la guía22. Por lo tanto, evaluamos la frecuencia de adenina en función de la puntuación de pantalla promedio de las dos condiciones. Este análisis reveló una correlación significativa (Pearson = 90,4 %, p < 10−20) entre la frecuencia de los shRNA del SARS-CoV-2 sin adenina en su posición 20 y la estadística de pantalla promedio (Fig. 2b). De hecho, los shRNA superiores en nuestra pantalla prácticamente se agotaron en adenina en la posición 20. Finalmente, comparamos los resultados de nuestra pantalla con las predicciones de potencia de shRNA in-silico producidas por un algoritmo de aprendizaje automático publicado26 (Fig. 2c). Si bien la predicción de estos algoritmos estuvo lejos de ser perfecta para cada disparador de ARNi individual, encontramos una correlación altamente significativa (Pearson = 90,6 %, p < 10-20) entre las puntuaciones de este algoritmo y nuestra puntuación de pantalla promedio.

Las puntuaciones de la pantalla tuvieron una alta consistencia interna. Los resultados de la pantalla mostraron una correlación de Pearson del 72,2 % entre las puntuaciones en las dos condiciones de mayor rendimiento; b Enriquecimiento de características asociadas con potentes shRNA. La probabilidad de no encontrar una adenina en la posición 20 de los desencadenantes de ARNi dirigidos al SARS-CoV-2 aumentó con las puntuaciones de la pantalla, recapitulando estudios previos que indican que cuando la adenina ocupa la posición 20, debilita la maduración del ARNhc; c Puntuaciones de pantalla altamente correlacionadas con predicciones bioinformáticas. Las puntuaciones de la pantalla, que representan las estadísticas de enriquecimiento calculadas por DESeq2, estaban altamente correlacionadas con un algoritmo de aprendizaje automático publicado que predecía la potencia de los shRNA; d Resultados de la pantalla y los candidatos seleccionados. El gráfico muestra las puntuaciones de pantalla resultantes de cada activador de ARNi que pasó el umbral de calidad, en función de la posición a lo largo del genoma viral. Naranja: activadores de ARNi que se dirigieron a regiones conservadas entre el SARS-CoV y el SARS-COV-2. Verde: Los diez candidatos seleccionados. Azul: todos los demás instaladores de RNAi; e Curvas dosis-respuesta de los diez candidatos seleccionados. Los siRNA se probaron usando un ensayo reportero. El gráfico representa la relación mediana estandarizada entre la expresión de mCherry (gen informador) y GFP (gen de control); f Puntuaciones de potencia de cada uno de los 10 candidatos seleccionados. El valor IC50 de cada uno de los 10 candidatos se calculó en base a las curvas dosis-respuesta en (e). Los errores estándar para los cálculos de IC50 se calcularon utilizando un arranque estadístico sobre todos los puntos de datos en cada nivel de concentración.

Alentados por estos resultados, seleccionamos manualmente diez candidatos para una mayor experimentación (Tabla 1; Fig. 2d). Los primeros cinco candidatos (S1-S3 y S5-S6) se seleccionaron principalmente en función de su puntaje de pantalla promedio en las dos condiciones de mejor desempeño mientras se esforzaban por representar múltiples genes de virus. Los otros cinco candidatos (S4 y S7-S10) también se seleccionaron en función de sus puntajes de pantalla, pero se restringieron a regiones de 22 miembros que se conservaron por completo entre el SARS-CoV y el SARS-CoV-2, ya que supusimos que estas regiones podrían ser aplicables a futuros los efectos secundarios de los beta-coronavirus también. Para probar nuestros shRNA preseleccionados, clonamos su región objetivo en la 3'UTR de mCherry y convertimos cada shRNA en su correspondiente siRNA. Luego transfectamos cada reportero con dosis reducidas de su siRNA correspondiente para identificar su concentración inhibitoria media máxima (IC50). Ocho de los diez siRNA probados exhibieron valores de IC50 por debajo de 50 pM (Fig. 2e, f; Tabla complementaria 2), cinco de los cuales demostraron valores de IC50 por debajo de 20 pM. Solo un candidato, S9, mostró un valor de IC50 relativamente bajo en este ensayo (IC50 > 1,4 uM). En general, estos resultados muestran que nuestro nuevo método de detección de todo el genoma identifica siRNA hiperpotentes dentro de un solo ciclo.

Paralelamente a la pantalla Sens.AI, empleamos una tubería de descubrimiento más tradicional para identificar siRNAs contra SARS-CoV-2. Nuestra motivación era evaluar las estadísticas de rendimiento, las características técnicas y las propiedades logísticas de nuestra nueva tubería Sense.AI en comparación con los algoritmos de predicción de siRNA de última generación. Con este fin, utilizamos tres algoritmos de predicción de potencia de siRNA de código abierto: RNAxs27, DSIR28, OligoWalk29, para evaluar computacionalmente más de 815 sitios objetivo potenciales, centrándonos en regiones que previamente mostraron buenos resultados contra el SARS-CoV30,31,32. Hubo una correlación relativamente baja entre los algoritmos, en correlaciones de Spearman de entre 0,4 y 0,02 (Figura 3 complementaria). A continuación, seleccionamos manualmente los candidatos de siRNA que fueron consistentemente mejores en todos los programas, excluyendo candidatos con regiones de semillas complementarias al transcriptoma humano. Esta lista arrojó 88 siRNA que sintetizamos y probamos mediante el mismo ensayo informador (a 1 nM por candidato) descrito anteriormente. Luego, priorizamos los 27 siRNA más prometedores y los volvimos a probar a concentraciones de 500 pM y 100 pM (Fig. 4 complementaria), encontrando que 9 de estos 27 candidatos inhibieron la expresión del reportero en más del 50% (100 pM).

A continuación, evaluamos a nuestros principales candidatos desde la pantalla del sensor y desde la tubería bioinformática utilizando un ensayo de infección in vitro de SARS-CoV-2 vivo estándar de oro. Transfectamos células Vero E6 con 100 nM de cada uno de los candidatos a ARNip de Sens.AI por triplicado. Como control negativo, también transfectamos células con un siRNA simulado que se dirigía a eGFP. Después de 24 horas, desafiamos las células con 60xTCID50, 600xTCID50 o 6000xTCID50 del SARS-CoV-2 vivo (cepa ancestral). Finalmente, medimos el nivel de carga viral 48 horas después de la infección inicial mediante qPCR, sondeando los genes RdRP y E.

Descubrimos que seis de los nueve siRNA probados de nuestra pantalla pudieron reducir drásticamente la cantidad de ARN viral. Si bien los resultados fueron cualitativamente consistentes en los tres títulos de virus probados (Fig. 3 y Fig. 5a, b complementaria), decidimos centrarnos en el título de 600xTCID50 para experimentos futuros, porque produjo el mayor rango dinámico (Fig. 3a). En estas condiciones, nuestros cinco siRNA de mejor rendimiento reprimieron la carga viral genómica en >95 %. Curiosamente, tanto S8 como S10 mostraron respuestas débiles, a un nivel de ~10 % de inhibición del SARS-CoV-2 en comparación con el siRNA de control, a pesar de la potencia muy alta en el ensayo indicador (IC50 < 20 pM). Sin embargo, a diferencia de los otros candidatos a siRNA, estos dos se dirigen a la hebra negativa del virus, que es un intermediario en el proceso de replicación. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que apuntar a esta molécula de ARN intermediaria probablemente no interferiría con la replicación viral. Para confirmar aún más a nuestros principales candidatos, evaluamos el efecto sobre la infectividad del virus vivo en las células mediante el ensayo TCID50 (Fig. 3b). Nuevamente, encontramos una fuerte actividad inhibidora de los tres principales de los cuatro siRNA, con una represión viral que exhibe aproximadamente dos órdenes de magnitud en comparación con el control de siRNA de GFP. A continuación, usamos la misma configuración para probar cinco de los siRNA más potentes del método de descubrimiento de código abierto (Tabla complementaria 3). Solo un candidato, Hel14, mostró niveles de represión de la carga viral en >95 %, a la par de los niveles exhibidos por los mejores siRNA de nuestra pantalla Sens.AI (~90 % de inhibición) (Fig. 3c).

Azul y naranja: resultados de qPCR de las transcripciones de E y RdRP, respectivamente. A menos que se indique lo contrario, la carga viral al 100 % se calibró al nivel viral después del tratamiento con un siRNA anti-GFP. una carga viral de SARS-CoV-2 (cepa ancestral) después del tratamiento con los mejores candidatos de siRNA de la pantalla Sens.AI; b Niveles de TCID50 de SARS-CoV-2 (cepa ancestral) después del tratamiento con cuatro de las mejores moléculas de siRNA. En cada lote de experimentos, se usó un siRNA contra eGFP como control negativo (panel izquierdo n = 3, panel derecho n = 1, barras de error = SEM, la significancia se calculó usando la prueba t); c Carga viral de SARS-CoV-2 (cepa ancestral) después del tratamiento con el siRNA superior de la tubería bioinformática; d El efecto de varios cócteles de siRNA contra el SARS-CoV-2 (cepa ancestral). Los resultados se calibraron a la represión de S3 a la misma concentración; e Carga viral de SARS-CoV-2 (cepa ancestral) después del tratamiento con cócteles de siRNA en cultivo ALI. La carga viral se midió en medios recogidos de los medios a las 48, 72 y 96 horas después de la infección (n = 2 muestras independientes, barras de error = SEM). f Carga viral posterior al tratamiento con cócteles de siRNA contra SARS-CoV-2 Delta versus la cepa ancestral (n = 3 muestras independientes, barras de error = SEM). g Carga viral de SARS-CoV-2 Omicron versus la cepa ancestral después del tratamiento con el cóctel S5/Hel14 y otro tipo de antivirales; ( h ) Análisis DeSEQ2 del tratamiento con replicón de SARS-CoV-2 con el cóctel de ARNip S3/S5. Observamos una fuerte disminución de la cobertura alrededor de los sitios de división S3 (~ 23,5 kbase) y S5 (~ 28 kbase) a lo largo de la secuencia del replicón (valores FDR 4 × 10-83 y 6 × 10-22, respectivamente). Las barras de error en los paneles ef representan la división estándar, basada en tres repeticiones.

A continuación, buscamos la combinación óptima de pares de siRNA entre nuestros candidatos con mejor rendimiento. Estos cócteles incluyeron cuatro siRNA de la pantalla Sens.AI, aumentados por tres de los siRNA más prometedores de la tubería de descubrimiento de código abierto. Probamos 14 cócteles de 2-siRNA diferentes en el ensayo de virus vivo y comparamos los resultados con la represión por S3 solo, porque como monoterapia había mostrado el nivel de represión más alto (Fig. 3d). Identificamos cinco cócteles donde los dos componentes de siRNA exhibieron un efecto sinérgico, multiplicado por varios pliegues en comparación con la represión por S3 solo a la misma concentración. S5 resultó ser un componente repetido en la mayoría de estos cócteles y decidimos priorizar dos de estos cócteles en el futuro: S5/S3 y S5/Hel14.

Para validar aún más estos cócteles de siRNA, probamos su actividad en un cultivo de interfaz aire-líquido que imita mejor el tracto respiratorio en comparación con las células VeroE6. Transfectamos el cultivo ALI desde el lado apical con 100 nM de cada cóctel. Como control negativo, también transfectamos células con un siRNA simulado que se dirigía a eGFP. Después de 24 h, desafiamos las células del lado apical con 600xTCID50 del SARS-CoV-2 vivo (cepa ancestral). Finalmente, medimos el nivel de carga viral a las 48, 72 y 96 horas después de la infección inicial mediante qPCR, sondeando los genes RdRP y E. Encontramos una fuerte inhibición de la replicación viral para ambos cócteles en estas condiciones (Fig. 3e).

Nuestros cócteles demostraron ser altamente resistentes a los COV emergentes. Primero, probamos los cócteles contra la cepa ancestral versus la variante Delta. Los cócteles confirieron una represión sustancial contra Delta, a la par de su efecto sobre la cepa ancestral (> 95% de represión) (Fig. 3f). Curiosamente, S5 fue tolerante y mostró eficacia contra la cepa Delta a pesar de que posee una mutación en la posición 14 de su sitio objetivo. En segundo lugar, probamos el cóctel S5/Hel14 contra Omicron BA.1 usando una configuración similar. Al igual que en otros informes33, la variante de Omicron no se replicó tan rápido como otros VoC in vitro. Dado que estas tasas de replicación más bajas redujeron el rango dinámico de nuestros ensayos, agregamos dos controles positivos, cloroquina y molnupiravir, los cuales demostraron ser potentes inhibidores de Omicron BA.1. De hecho, la actividad del cóctel S5/Hel14 disminuyó en la variante Omicron. Sin embargo, inhibió la replicación viral a un nivel similar al inducido por los tratamientos de control positivo (Fig. 3g). Este hallazgo sugirió que la inhibición más modesta probablemente fue el resultado de un rango dinámico más bajo debido a la replicación viral lenta, en lugar de una potencia reducida del cóctel de ARNi en sí. Finalmente, probamos la actividad de los cócteles contra nuestro novedoso sistema de replicón, que recapituló la función, pero no la infectividad de la cepa Beta SARS-CoV-234. De manera consistente, los cócteles reprimieron el replicón entre 10 y 15 veces, lo que indica que confieren un perfil de inhibición sólido en diversos VoC34. Es importante destacar que el análisis de los datos de secuenciación de alto rendimiento mostró que las células que se trataron con el cóctel S3/S5 exhibieron un perfil específico de agotamiento de lecturas en los sitios de escisión de siRNA (Fig. 3h). Estos datos brindan apoyo mecánico para confirmar que la reducción observada en la carga viral estaba directamente relacionada con el silenciamiento del siRNA.

A continuación, exploramos la reactividad cruzada de nuestra estrategia de ARNi contra futuros VoC, dado su uso previsto en el contexto de la preparación para una pandemia. Con este fin, desarrollamos un ensayo de mutagénesis de saturación utilizando nuestra estrategia Sens.AI. Repetimos la misma estrategia RNAi-off/RNAi-on que la pantalla SARS-CoV-2. La única diferencia fue que en la pantalla anterior empleamos una variedad de disparadores de shRNA y un sitio de destino perfectamente coincidente, mientras que en este ensayo, arreglamos el disparador de shRNA para que fuera S5 y creamos una serie de sitios de destino mutados (Fig. 4a) . Utilizamos esta estrategia para seleccionar 2143 mutaciones en el sitio objetivo S5, evaluando exhaustivamente prácticamente todas las sustituciones posibles en este sitio. Hasta donde sabemos, esta es la mayor mutagénesis de saturación en celuloide jamás realizada con un disparador de ARNi.

a El esquema de diseño de los oligos utilizados en este entorno. La biblioteca consistía en el S5 como desencadenante del shRNA con 2143 mutaciones, lo que representaba de manera exhaustiva todos los posibles desajustes simples y dobles en el sitio objetivo del siRNA; b El efecto de los desajustes estratificados por posición para n = 66 shRNA con un solo desajuste. El eje X representa las posiciones a lo largo del hilo guía. Azul: valores medios. Amarillo: efecto medio suavizado; Los cuadrados representan la media, las líneas horizontales representan la mediana, los bordes de las cajas representan los cuartiles del 25 % y el 75 %, y los bigotes representan los puntos de datos más lejanos dentro de hasta el 50 % del rango intercuartílico. c La distribución del efecto de las mutaciones en la actividad de S5. La línea vertical en 1,0 (eje X) significa puntuaciones que son idénticas a la puntuación de pantalla de un sitio de destino sin ninguna mutación. Negro: la distribución de los efectos de las 2143 mutaciones simples y dobles. Gris: la distribución de todas las mutaciones individuales. Naranja: la distribución de todas las transiciones dobles. Rojo: la distribución de todas las dobles transversiones.

Validamos la pantalla de mutagénesis de saturación replicando tendencias anteriores sobre desajustes de objetivos de siRNA. Estratificamos los resultados en función del número de desajustes. En promedio, un solo desajuste en el sitio de destino redujo las puntuaciones de Sens.AI en un 6 % en comparación con ningún desajuste. Como era de esperar, esta cifra fue significativamente menor (prueba t, p < 3 × 10−10) que la observada para los desajustes dobles, que redujeron las puntuaciones de Sens.AI en un 31 % en promedio. A continuación, analizamos el efecto de la posición de un solo desajuste en la actividad de S5 (Fig. 4b). De manera similar, de acuerdo con estudios previos35, la región de la semilla mostró la mayor sensibilidad a los desajustes, mientras que el sitio de escisión mostró una sensibilidad relativamente menor a estas mutaciones.

En general, nuestra pantalla de alto rendimiento mostró que el sitio objetivo S5 podía tolerar una amplia variedad de mutaciones sin una pérdida significativa de potencia (Fig. 4c; Fig. 6 complementaria). La mayoría de las mutaciones individuales (56 %) mejoraron la puntuación de Sens.AI y se esperaba que aumentaran la potencia de S5, lo que podría atribuirse a la dinámica de disociación de Ago235. Por el contrario, estimamos que S5 perdería la mayor parte de su potencia en el caso de una doble mutación en el sitio objetivo. Para comprender mejor la dinámica de estas mutaciones dobles, comparamos el efecto estimado de las transiciones dobles con las transversiones dobles. Nuestros resultados muestran que las transiciones dobles fueron mucho mejor toleradas. La mayoría de las transiciones dobles dieron como resultado una reducción de <32 % en la puntuación de Sens.AI, mientras que la mayoría de las transversiones dobles dieron como resultado una reducción de >51 % en esta puntuación. Según estudios previos, el primer tipo de mutación es siete veces más común que el último36, lo que sugiere que S5 podría tolerar hasta cierto punto el tipo más frecuente de mutaciones dobles en el sitio objetivo.

Para evaluar la eficacia preventiva de nuestros cócteles de siRNA en un modelo de enfermedad de COVID-19, administramos el cóctel S5/Hel14 a hámsters sirios como medida preventiva para un desafío de virus vivo. Decidimos usar este cóctel en lugar del S3/S5, ya que S3 se dirige a la región de codificación de Spike, que es propensa a mutaciones como mecanismo de escape de vacunas y mAb. Empleamos un régimen de dosificación que consistía en una dosis de ~400 ug/kg del cóctel de siRNA por día en los días -7, -3 y -1 utilizando nuestra fórmula patentada de administración pulmonar selectiva. Además, usamos el mismo régimen de dosificación para tratar a otro grupo de hámsteres con un siRNA conocido y muy potente contra el virus de la hepatitis C (VHC), como control negativo. Como no hay un fármaco intranasal disponible que podamos usar como control positivo, administramos bamlanivimab37 (LY-COV555, que recibió una autorización de uso de emergencia de la FDA para el tratamiento de COVID-19) por vía intraperitoneal (ip) el día −1 al control positivo. grupo. Cada grupo estaba compuesto por seis hámsters machos y los desafiamos por vía intranasal en el día 0 con 4 × 103 PFU de la cepa SARS-CoV-2 ancestral WA-1.

Nuestros resultados muestran que el cóctel de siRNA confirió protección contra la infección por SARS-CoV-2 cuando se usó como profilaxis previa a la exposición (PrEP) en el modelo estándar de enfermedad del hámster sirio (Fig. 5a). El grupo de control negativo exhibió una pérdida de peso promedio de >7 % en el día 5 posterior a la infección, en consonancia con estudios previos38,39,40. El grupo tratado con siRNA se benefició de una protección significativa contra la pérdida de peso en comparación con este grupo de control negativo (p <0,05; prueba de hipótesis de arranque y ajuste de Bonferroni) (Fig. 5b). Esta pérdida de peso fue estadísticamente indistinguible del grupo de control positivo que fue tratado con bamlanivimab. Además, observamos una supresión de orden de magnitud de la carga viral en los pulmones del grupo de tratamiento activo (Día 5) en comparación con el control negativo, según lo medido por la medición de qPCR del gen RdRP (ΔVLlung = 10,3x, plung < 0,001; prueba de hipótesis bootstrap y Bonferroni ajustado) (Fig. 5c). De manera similar, también observamos una supresión significativa, aunque en menor medida, de la carga viral en las fosas nasales (ΔVLlung = 2.5x, plung < 0.05; prueba de hipótesis de arranque y ajuste de Bonferroni) (Fig. 5d). En ambos casos, el anticuerpo fue más efectivo que el tratamiento con siRNA, lo que sugiere que se requieren estudios de optimización de dosis adicionales para desarrollar completamente el cóctel de siRNA en un profiláctico viable.

un régimen de dosificación. Los hámsters sirios (n = 6, por grupo) tratados previamente con un siRNA no dirigido (control negativo, gris), el anticuerpo LY-CoV555 (control positivo, amarillo) o nuestro cóctel de siRNA principal (tratamiento, rojo) se infectaron con 4 × 103 PFU de la cepa ancestral SARS-CoV-2; b Cambio de peso post infección. Diagrama de caja del cambio de peso por grupo de tratamiento en relación con el tiempo posterior a la infección; c, d Carga viral en el día 5 después de la infección. Todas las mediciones se basaron en qPCR del gen RdRP cinco días después de la infección de pulmones homogeneizados c y fosas nasales d. En todos los paneles el valor p se presenta como: *<0,05,**<0,001. Control: controlar; CV: carga viral; Negativo: negativo; Pos.: positivo; tratamiento: tratamiento; ns: no significativo. En los paneles b–d, las líneas horizontales representan la mediana, los bordes de las cajas representan los cuartiles del 25 % y el 75 %, y los bigotes representan los puntos de datos más lejanos dentro de hasta el 50 % del rango intercuartílico. Los valores de P se calcularon utilizando bootstrap paramétrico (Métodos).

También probamos el mismo cóctel de siRNA en tres formatos adicionales: siRNA modificados químicamente administrados por vía intranasal (variación n.° 1; figura complementaria 7), mismos siRNA modificados químicamente administrados por nebulización (variación n.° 2) y siRNA desnudos administrados por nebulización (variación n.° 3) (Métodos). Tanto la variación de tratamiento n.° 1 como la n.° 2 mostraron una reducción significativa en la carga viral del pulmón (variación de inmersión n.° 1 < 0,001; variación de inmersión n.° 2 < 0,001; prueba de hipótesis de arranque y ajuste de Bonferroni) (Fig. 8a complementaria). Además, encontramos una reducción más pequeña pero significativa de la carga viral de las fosas nasales (variación plung n.º 1 < 0,001; variación n.º 2 < 0,05; prueba de hipótesis de arranque y ajuste de Bonferroni) (Fig. 8b complementaria). Sin embargo, ninguna de estas variaciones protegió contra la pérdida de peso medida en el Día 5 (Fig. 8c complementaria), lo que sugiere que pueden mostrar una farmacocinética más lenta que el brazo de tratamiento primario o inducir un desafío de tolerabilidad.

En conjunto, nuestros resultados muestran que el tratamiento con siRNA puede proteger eficazmente el tracto respiratorio superior contra la infección por SARS-CoV-2, atenuando significativamente la infección como lo reflejan las mediciones de la carga viral y las manifestaciones clínicas ejemplificadas prototípicamente por la pérdida de peso.

La profilaxis, particularmente del tipo resistente a la aparición de nuevas variantes de preocupación (VoC), se ha identificado repetidamente como un componente faltante en el arsenal de terapias utilizadas para combatir la pandemia continua de COVID-19. Los siRNA presentan una modalidad atractiva para el tratamiento profiláctico y, de hecho, durante el primer brote de SARS, diferentes investigadores identificaron siRNA para atacar el genoma del virus. Sin embargo, de más de 9000 secuencias publicadas, solo 12 siRNA coincidían perfectamente con el genoma del SARS-Cov2. En este estudio, informamos, por primera vez hasta donde sabemos, sobre una pantalla sistemática de ARNi de todo el genoma contra el SARS-CoV-2. Probamos más de 16 000 disparadores de ARNi en un ensayo informador paralelo masivo y validamos los mejores resultados en un ensayo de virus vivo in vitro. Además, probamos 88 siRNA identificados a través de métodos de descubrimiento in-silico de código abierto. Luego probamos múltiples pares de siRNA como tratamientos combinados en el ensayo de virus vivo para identificar instancias en las que los componentes de siRNA confieren efectos sinérgicos cuando se combinan. Estos cócteles demostraron ser activos contra tres cepas diferentes del virus, a saber, Beta, Delta y la ancestral. Una selección exhaustiva de las 2143 mutaciones simples y dobles en uno de los sitios de destino confirmó aún más la baja probabilidad de pérdida de actividad frente a futuros VoC. Finalmente, mostramos la eficacia de estos cócteles como preventivos previos a la exposición contra la infección por SARS-CoV-2 en hámsteres sirios.

Nuestro estudio también tiene ciertas limitaciones. Primero, en su constelación actual, los cócteles de siRNA se diseñaron como profilácticos agudos. No está claro por cuánto tiempo permanecen efectivos y, por lo tanto, podrían ser más apropiados en situaciones donde existe un alto riesgo de exposición, como en el caso de los trabajadores de primera línea, inmunodepresión (transitoria o crónica), un brote en el hogar y durante la altura o una "ola" de infección. En segundo lugar, aunque nuestro cóctel de ARNip protegió a los hámsters sirios de enfermedades, el efecto se observó principalmente en el tracto respiratorio superior. Si bien este es el sitio principal de infección y muestra una gran promesa en términos de mitigación de la transmisión, requerirá una mayor adaptación para su uso en un entorno de tratamiento, lo que requeriría la optimización para la administración al tracto respiratorio inferior y al parénquima pulmonar. En tercer lugar, para los fines de este estudio de prueba de principio, adoptamos un régimen de tratamiento previo a la exposición que se componía de la administración de varios días antes de la infección. Nuestro objetivo es optimizar aún más el régimen antes de avanzar a los NHP y, en última instancia, a los ensayos clínicos en humanos.

A pesar de estas advertencias, el estudio actual contribuye sustancialmente a los esfuerzos globales para frenar el COVID-19, así como otras futuras pandemias virales de proporciones similares de mortalidad y morbilidad. Aquí ilustramos la eficacia de los cócteles de siRNA administrados por vía intranasal como preventivos previos a la exposición resistentes a la probable evolución mutacional de los patógenos culpables. Esto es particularmente alentador dada la tasa alarmante a la que actualmente estamos presenciando la aparición de nuevas variantes del SARS-CoV-2 resistentes a las terapias de las clases de vacunas y mAb neutralizantes. Es importante destacar que nuestro enfoque propuesto no se ve afectado por las mutaciones de Spike, ni se basa en un sistema inmunológico funcional. En cambio, aprovecha la vía natural del ARNi, activa en las células epiteliales de revestimiento del tracto respiratorio, que son el punto focal de la transmisión de infecciones, y es completamente ortogonal a las vacunas y otros enfoques inmunomoduladores. Finalmente, las proporciones globales de la pandemia actual y los requisitos restrictivos de almacenamiento y envío de la cadena de frío asociados con muchas de las vacunas y las terapias aprobadas por mAb exigen urgentemente una solución duradera que también sea accesible para las zonas rurales de difícil acceso. poblaciones menos ricas. Nuestra administración intranasal permite un despliegue generalizado que no depende de una infraestructura médica novedosa o avanzada para la accesibilidad. Creemos que este estudio ilustra un cambio de paradigma en el enfoque de la preparación para una pandemia, y esperamos que nuestro proceso de descubrimiento y validación sea aplicable a otras amenazas patógenas emergentes, incluidos los nuevos beta-coronavirus y la influenza.

Las células HEK293FT (ThermoFisher Scientific) y VeroE6 (ATCC) (y sus derivados) se cultivaron en DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco), complementado con suero bovino fetal al 10 %, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 μg/ml (todos los productos Thermo Fisher). Scientific), a 37 °C con 5% de CO2. La línea celular HEK293FT se obtuvo de Thermo Scientific (n.º de cat. R70007). El cultivo de interfaz aire-líquido (MucilAir) se adquirió de Epithelix.

La línea celular HEK293FT-Dicer Knock-Out (KO) fue diseñada por CRISPR/Cas9 en la línea celular parental 293FT. El RNA guía (gRNA) tenía la siguiente secuencia: AAGAGCUGUCCUAUCAGAUC. El ARNg se modificó con una modificación de fosforotioato para evitar la degradación por nucleasa y se obtuvo de Merck-Millipore. Se complejaron 80 pmol de gRNA con 4 ug de proteína TrueCut Cas9 (ThermoFisher) y se transfectaron a las células usando el nucleofector Amaxa. La eficiencia de KO se determinó mediante secuenciación de Sanger.

Para cada siRNA candidato, extrajimos su secuencia objetivo dentro de un contexto de 150 pares de bases. La secuencia diana se clonó en pLMN-ZsGreen-Neomicina (Transomics) en la 3'UTR de una proteína informadora mCherry expresada constitutivamente. Las células HEK293FT se transfectaron con Lipofectamine 3000 (Life Technologies) de acuerdo con las pautas del fabricante, ya sea con el sensor solo o con el sensor más siRNA en la concentración relevante. Se cotransfectó un segundo plásmido que expresaba eGFP en una proporción molar de 1:1, sirviendo como control interno para la eficiencia de la transfección. Las células se recolectaron y analizaron 48 h después de la transfección usando un citómetro de flujo MACSquant VYB (Milteyi Biotec). La potencia de cada candidato se evaluó como la relación mediana de la amplitud de radiación de mCherry a eGFP. La figura complementaria 9 presenta la estrategia de activación utilizada en estos experimentos.

La biblioteca de shRNA-Sensor se ensambló mediante un procedimiento de dos pasos. Se obtuvo de Twist Bioscience una biblioteca de aproximadamente 20 000 oligonucleótidos en los que cada shRNA se unió a su sensor afín mediante un enlazador que albergaba sitios de restricción EcoRI y MluI. La biblioteca primero se amplificó mediante PCR y se clonó usando XhoI y MfeI en un vector retroviral receptor. Este último contenía el miR30 resistente a la higromicina, incluida su porción 5' (5'mir30). En el segundo paso, se insertó un casete 3'mir30-PGK-Venus entre el shRNA y su Sensor, integrado a través de los sitios EcoRI y MluI en el enlazador.

Todos los plásmidos para el ensayo informador y Dicer desestabilizado se construyeron en un andamio pZIP lentiviral obtenido de Transomics (pZIP-SFFV-ZsGreen-Puro), que se había modificado previamente para cambiar el casete SFFV-ZsGreen con el promotor EF1alpha solo. Para el ensayo informador, clonamos un casete de expresión aguas abajo del promotor EF1aplha a través de Gibson Cloning, que consistía en un fragmento sensor 3xFLAG-EGFP-NLS o mCherry-STOP-150bp. Para el ddDicer desestabilizado, el dominio de desestabilización 41 y el Dicer142 humano se amplificaron mediante PCR y se ensamblaron en pZIP-EF1aplha mediante una clonación Gibson de 3 vías. La construcción final tenía la siguiente estructura EF1a::dd-Dicer1-IRES-Puro.

Todos los estudios in vitro con un virus vivo se realizaron en instalaciones de nivel de contención 3 en el Instituto de Inmunología Terapéutica y Enfermedades Infecciosas de Cambridge (CITIID) según los protocolos y procedimientos operativos estándar aprobados.

El aislado clínico de Sars-cov-2/human/Liverpool/REMRQ001/2020, un aislado de primera ola designado como WT, se propagó en Vero-E6 y se usó principalmente para infecciones de virus vivos en este estudio. Se realizaron experimentos adicionales utilizando variantes Delta y Omicron recién emergidas. Los virus SARS-CoV-2 infecciosos vivos propagados, B.1.1.617.2 (Delta) y B.1.1.529 (Omicron) fueron recibidos amablemente de la profesora Wendy Barclay (Imperial College London) y el Dr. Jonathan Brown (Imperial College London) como parte del trabajo realizado por G2P-UK National Virology Consortium. El aislado del virus correspondiente a la variante Omicron, gentilmente donado por Gavin Screaton en la Universidad de Oxford, se propagó en células Vero-ACE2-TMPRSS2 (VAT) durante 3 días hasta que se observó el efecto citopático.

Se prepararon células Vero E6 transfectadas con GFP de control o siRNA/s experimental/es en 96 pocillos. A menos que se indique lo contrario, se transfectaron 10 000 células VeroE6 con 100 nM de tratamiento con ARNip y se infectaron con SARS-Cov-2 24 horas después del tratamiento con ARNip. Las células se infectaron por triplicado biológico con SARS-CoV-2 WT, variante Delta y Omicron a moi 1 o 0,1 TCID50 por célula en 50 µl de DMEM con o sin inhibidores conocidos de SARS-CoV-2. Las infecciones se incubaron hasta 48/72 h después de la infección (pi), y los sobrenadantes de cultivos celulares se recolectaron a las 0, 24, 48 y/o 72 h pi, donde se cuantificaron los ARN virales por RT-qPCR y/o las unidades de virus infecciosos se titularon por TCID50. Después de eso, se recogieron 40 ul del medio directamente en 160 ul de reactivo TRIzol™ LS (ThermoFisher). El ARN viral se extrajo con los kits de ARN Direct-zol-96 (investigación ZYMO) y se usó como plantilla para qRTPCR para medir el número de copias virales. Se usó difosfato de cloroquina (BioVision) a una concentración final de 50 uM y Molnupiravir (Focus Biomolecules) a una concentración final de 20 uM. La secuenciación del replicón Beta fue descrita previamente34.

Se prepararon diluciones en serie de diez veces de los sobrenadantes de virus recogidos en medio de cultivo DMEM. De estas diluciones, se inocularon 50 µl en monocapas de células Vero E6 cultivadas en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C en un incubador con CO2 al 5 %. Los títulos de virus se recogieron a los 4 días pi y se expresaron como valores de TCID50 ml-1 mediante el método de Reed-Muench43.

El número de copias del genoma viral se midió mediante qPCR utilizando el panel de sonda de cebadores (IDT) de Charité/Berlin y la mezcla maestra TaqPath™ 1-Step Multiplex (ThemoFisher). Luego comparamos los valores promedio de Ct de cada condición con los valores de Ct de eGFP siRNA.

Los oligos para el ensayo de saturación de mutagénesis S5 se obtuvieron de Twist Bioscience y se clonaron en la biblioteca de shRNA-Sensor como se describe anteriormente. Similar a la pantalla anterior, también incorporamos 948 shRNA de control de Fellmann et al.22, 511 que son muy potentes y 437 de baja potencia. Esta pantalla siguió una estructura similar a la pantalla de todo el genoma con algunas modificaciones: (a) modulamos la maquinaria de ARNi con solo tres condiciones: regulación positiva de Dicer, regulación negativa de Dicer y sin modulación. Se construyó una tubería de aprendizaje automático para distinguir entre el shRNA de control potente y débil. El mejor clasificador se eligió mediante validación cruzada y tuvo una tasa de precisión del 81,1 % en promedio (SE del 1,14 %). El clasificador asigna una puntuación de potencia para cada par desencadenante-objetivo en el ensayo. El efecto de cada objetivo mutado se determinó como la puntuación del clasificador para el par desencadenante-objetivo mutado sobre la puntuación del par desencadenante-objetivo perfectamente coincidente.

Se trataron hámsteres sirios dorados machos de 6 a 8 semanas de edad con cócteles de siRNA en los días -7, -3 y -1 antes de la infección. La administración intranasal (IN) se realizó en hámsters en el estudio utilizando una formulación patentada. Cada hámster se colocó en una almohadilla quirúrgica estéril y se estiró ligeramente para colocar mejor un agarre firme en el pescuezo. El hámster estaba boca arriba para permitir que el hámster respirara y se sintiera cómodo. Con el cuello y la barbilla planos y paralelos a la almohadilla, la punta de la pipeta se colocó cerca de la fosa nasal izquierda del hámster en un ángulo de 45 grados, y se administraron 5 μL del material de dosificación en la fosa nasal con un movimiento de 2 a 3 segundos. intervalo intermedio para un total de 25 μL/fosa nasal. El hámster se mantuvo en esta posición durante 5 segundos o hasta que recuperó la conciencia, luego se repitió la administración para la otra fosa nasal para un total de 50 μL/hámster. Después del procedimiento, el hámster se devolvió a su jaula y se controló durante 5 a 10 minutos para detectar cualquier reacción adversa.

Para las administraciones con nebulizador, los ARNip se diluyeron en PBS + gelatina 0,5 mg/ml. El aerosol se produjo usando Nebulización de Mash Vibrante (VMN), y la nebulización se realizó en un Gabinete de Seguridad Biológica (BSC).

Cuando estaba indicado, se administró 1 mg de mAb555 por vía intravenosa el día -1. En el día 0, los hámsteres se infectaron con SARS-CoV-2 mediante infección intranasal de 4 × 103 PFU de virus. En el día 5 después de la infección, se sacrificaron los hámsteres y se recogieron la tráquea y el pulmón para su posterior análisis.

Calculamos todos los valores de p a través de pruebas de hipótesis de arranque, restando de cada hámster la media de su grupo, muestreando hámsteres de cada grupo con reemplazo 20000 veces y calculando la fracción de muestras en las que la diferencia entre las medias era mayor que la real. diferencia. Los valores de p presentados son después de la corrección de Bonferroni para los cuatro brazos.

Realizamos la pantalla covid inicial (Fig. 1) utilizando dos réplicas (definidas como celdas ordenadas separadas). Realizamos la validación de la pantalla (Fig. 2) usando dos réplicas (definidas como experimentos de transfección separados) para cada siRNA probado en cada concentración. Realizamos el experimento de virus vivo (Fig. 3) usando 3 réplicas (definidas como experimentos de infección celular separados) para cada siRNA y realizamos análisis estadísticos usando la prueba de Dunnett. Realizamos el análisis de mutagénesis por saturación (Fig. 4) utilizando 2143 siRNA diferentes, probando tres desajustes diferentes por posición. Realizamos los experimentos in vivo (Fig. 5) usando seis hámsteres por grupo y realizamos análisis estadísticos usando pruebas de hipótesis de arranque (restar de cada hámster la media de su grupo, volver a muestrear hámsteres de cada grupo con reemplazo 20000 veces y calcular la fracción de muestras en las que la diferencia entre las medias fue mayor que la diferencia real).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de los experimentos de ensayo del sensor, los datos sin procesar y los archivos de metadatos están disponibles a pedido. Los datos de origen para gráficos y figuras se incluyen en los datos complementarios 1-5.

El código requerido para replicar los resultados está disponible de los autores previa solicitud.

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Este estudio fue financiado en parte por la Fundación Bill y Melinda Gates y por el programa interno de los Institutos Nacionales de Salud. Los hallazgos y conclusiones contenidos en este son los de los autores y no reflejan necesariamente las posiciones o políticas de la Fundación Bill y Melinda Gates. Este trabajo se realizó en parte bajo CRADA 2020-0597 entre VRC/NIAID y Eleven Therapeutics. Parte del trabajo fue financiado por subvenciones de investigación a IG de Wellcome Trust, número de referencia. 207498/Z/17/Z y MRC/UKRI G2P-UK National Virology consortium, número de referencia. MR/W005611/1. IG es miembro sénior de Wellcome Trust.

Estos autores contribuyeron por igual: Ohad Yogev, Omer Weissbrod, Giorgia Battistoni, Dario Bressan.

Eleven Therapeutics, Cambridge, Reino Unido

Ohad Yogev, Giorgia Battistoni, Dario Bressan, Adi Naamati, Ilaria Falciatori y Ahmet Can Berkyurek

Eleven Therapeutics, Tel-Aviv, Israel

Omer Weissbrod, Roni Rasnic, Shaul Ilan y Yaniv Erlich

CRUK Cambridge Institute, Universidad de Cambridge, Centro Li Ka Shing, Cambridge, Reino Unido

Giorgia Battistoni, Dario Bressan y Gregory James Hannon

Universidad de Cambridge, Departamento de Patología, División de Virología, Cambridge, Reino Unido

Rhys Izuagbe, Myra Hosmillo & Ian Goodfellow

Eleven Therapeutics, Cambridge, MA, EE. UU.

Iris Grosman

Centro de Investigación de Vacunas, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.

Lauren McCormick, Christopher Cole Honeycutt, Timothy Johnston, Matthew Gagne y Daniel C Douek

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OY y YE escribieron este documento con aportes de GB, DB, OW y MGOY, YE y OW redactaron las figuras y tablas. OY, GB, DB, AN e IF y ACB llevaron a cabo los experimentos in vitro. RI, MH e IGG llevaron a cabo experimentos con virus vivos y realizaron análisis estadísticos. LM, TJ, CCH y MG llevaron a cabo el estudio in vivo. YE, OW y RR realizaron análisis de datos de secuenciación y realizaron análisis estadísticos. YE, SI, IG, DD, GJH contribuyeron a la discusión y diseños de estudio.

Correspondencia a Ohad Yogev.

OY, OW, AN, IF, ACB, RR, SI, IG y YE son empleados de Eleven Therapeutics. GJH es el cofundador de Scientific y tiene acciones en Eleven Therapeutics. GB y DB tienen acciones en Eleven Therapeutics. IG actuaba como asesor en Eleven Therapeutics cuando se realizó este trabajo.

Todos los estudios in vivo se realizaron de acuerdo con las normas y estándares de los NIH sobre el cuidado y el uso humanitarios de animales de laboratorio, así como con los Comités de Uso y Cuidado de Animales del Centro de Investigación de Vacunas de los NIH y BIOQUAL, Inc. (Rockville, Maryland). Todos los estudios se realizaron en BIOQUAL, Inc.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Zhijuan Qiu. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Yogev, O., Weissbrod, O., Battistoni, G. et al. Desde una pantalla de todo el genoma de moléculas de ARNi contra el SARS-CoV-2 hasta una profilaxis potente y de amplio espectro validada. Commun Biol 6, 277 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04589-5

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Recibido: 29 de octubre de 2022

Aceptado: 13 febrero 2023

Publicado: 16 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04589-5

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