El tratamiento con antibióticos puede exacerbar la biopelícula - Grupo Co., Ltd de los laboratorios de minería de Foshan

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, Número de artículo: 26 (2023) Citar este artículo

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La trampa de quórum, un proceso sociomicrobiológico que se basa en mutaciones en los sistemas de detección de densidad celular (detección de quórum), ha surgido como un contribuyente importante a la infección asociada a biopelículas en el principal patógeno humano Staphylococcus aureus. Esto se debe a que la inactivación del sistema de detección de quórum Agr estafilocócico conduce a una formación pronunciada de biopelícula, lo que aumenta la resistencia a los antibióticos y los mecanismos de defensa inmunitaria. Dado que las infecciones de biopelículas en la clínica generalmente progresan con el tratamiento con antibióticos, aquí investigamos si dicho tratamiento promueve la infección de biopelículas a través de la promoción de la trampa del quórum. El desarrollo del tramposo de quórum fue estimulado por varios antibióticos utilizados en el tratamiento de infecciones de biopelículas estafilocócicas más fuertemente en biopelículas que en el modo de crecimiento planctónico. Se investigaron las concentraciones subinhibitorias de levofloxacina y vancomicina por su impacto en la infección asociada a biopelículas (infección asociada a catéter subcutáneo y asociada a prótesis articular), donde, en contraste con un modelo de infección de piel subcutánea no asociada a biopelículas, un aumento significativo de la Se observó carga bacteriana y desarrollo de mutantes agr. Nuestros resultados demuestran directamente el desarrollo de la disfuncionalidad de Agr en modelos de infección asociada a biopelículas animales y revelan que el tratamiento antibiótico inadecuado puede ser contraproducente para tales infecciones, ya que promueve la trampa del quórum y el desarrollo asociado de biopelículas.

Las infecciones (nosocomiales) asociadas a la atención de la salud (IRAS) afectan a un promedio del 7,6 % de los pacientes hospitalizados en países de ingresos altos1. En los Estados Unidos, la mortalidad por HAI se ha estimado en ~99 000 muertes anuales2 y sigue siendo considerable a pesar de una disminución reciente3. En los países de bajos ingresos, la incidencia y la mortalidad de las HAI son aún mayores1,4. Muchas IRAS se derivan de infecciones de dispositivos médicos permanentes, como implantes quirúrgicos, dispositivos protésicos y catéteres del tracto urinario, intravenosos o asociados a vías centrales5. El desenlace frecuentemente fatal de las infecciones asociadas a dispositivos se debe principalmente a infecciones del torrente sanguíneo que se originan en los dispositivos infectados6,7. Por ejemplo, las infecciones del torrente sanguíneo asociadas a la línea central (CLABSI), uno de los tipos de HAI más mortales, tienen una tasa de mortalidad del 12% al 25%8. Las infecciones asociadas a dispositivos son notoriamente difíciles de tratar debido a la formación de biopelículas. Las biopelículas son aglomeraciones bacterianas que pueden cubrir la superficie interior y exterior del dispositivo y exhiben una resistencia pronunciada a los antibióticos9,10,11,12. Por esa razón, las infecciones asociadas a dispositivos siguen siendo particularmente difíciles de tratar, incluso con las estrategias modernas de desarrollo de fármacos13.

Una de las causas más frecuentes de infecciones asociadas a dispositivos es Staphylococcus aureus14. En comparación con otras bacterias que se encuentran a menudo en estas infecciones, como los estafilococos coagulasa negativos estrechamente relacionados, las infecciones asociadas a dispositivos con S. aureus suelen mostrar una progresión clínica y un resultado más graves debido a la virulencia más pronunciada de S. aureus14,15, dieciséis. S. aureus es famoso por su excepcional renuencia al tratamiento con antibióticos17, lo que se debe en parte a genes específicos de resistencia a los antibióticos, como mecA en S. aureus resistente a la meticilina (MRSA)17,18. Sin embargo, incluso los antibióticos que normalmente eliminan eficazmente el MRSA, como la vancomicina, tienen una actividad fuertemente reducida contra el MRSA en las biopelículas19,20, y las biopelículas formadas por S. aureus sensible a la meticilina (MSSA) también muestran una resistencia pronunciada al tratamiento con antibióticos21,22. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de resistencia a los antibióticos en la infección por biopelículas es esencial para mejorar las estrategias terapéuticas para este importante patógeno nosocomial.

Durante las últimas décadas, ha habido una intensa investigación sobre los fundamentos moleculares de la formación de biopelículas. En S. aureus y otros patógenos formadores de biopelículas, esto ha llevado a la identificación de una amplia variedad de moléculas que, con capacidad estructural, metabólica o reguladora, participan en la formación de biopelículas23,24. Por ejemplo, los sistemas de detección de quórum (QS), que adaptan la fisiología bacteriana a las condiciones cambiantes provocadas por el aumento de la densidad celular, tienen un papel clave en el desarrollo de biopelículas en muchas bacterias25,26. En S. aureus, hay un sistema QS, que se llama Agr para el regulador de genes accesorios27,28. Agr controla varios factores que contribuyen al desarrollo de la biopelícula, entre ellos las proteasas y nucleasas que degradan la matriz de la biopelícula y las modulinas solubles en fenol (PSM), que son péptidos anfipáticos que estructuran las biopelículas al prevenir las interacciones no covalentes entre las macromoléculas de la matriz23,29,30. La ausencia de PSM conduce a una menor formación de canales de biopelícula y, en general, a biopelículas más gruesas y compactas, en un grado pronunciado similar al observado en los mutantes agr, lo que indica un papel clave de los PSM en el desarrollo de biopelículas31. También confirmamos el papel de Agr y PSM en S. aureus y S. epidermidis en modelos de infecciones asociadas a biopelículas25,31,32,33,34. Sin embargo, estos representan ejemplos bastante raros en los que se utilizaron modelos de infección por biopelículas para confirmar la validez de los hallazgos in vitro25. En general, la dinámica de la infección por biopelícula sigue sin entenderse por completo.

Anteriormente informamos que los mutantes de S. aureus disfuncionales con Agr se desarrollan in vitro en una medida considerable32. El desarrollo de mutantes QS disfuncionales como S. aureus Agr-mutantes disfuncionales se denomina comúnmente "trampa de quórum" y se observó por primera vez para los sistemas QS de Pseudomonas aeruginosa35. La trampa de quórum describe el fenómeno sociomicrobiológico en el que algunas bacterias de una población bloquean la costosa secreción controlada por QS de enzimas degradantes que se necesitan para la adquisición de nutrientes, confiando en otros miembros de la población hasta lograr un equilibrio equilibrado de trampas y no trampas. desarrolla36.

Si bien se estableció predominantemente mediante investigación in vitro, existe evidencia de que principios similares de trampa de quórum y control de trampa de quórum también se aplican a la infección in vivo37,38. Es importante destacar que nosotros y otros hemos informado que los mutantes disfuncionales de Agr se pueden encontrar con frecuencia en aislados de infección por S. aureus y, en particular, en aquellos aislados de infecciones asociadas a biopelículas o infecciones de la sangre, que a menudo se derivan de biopelículas en dispositivos internos infectados39,40,41, 42,43. Investigaciones recientes en animales en nuestro laboratorio han indicado que el desarrollo de mutantes agr en infecciones asociadas a biopelículas no sigue completamente las predicciones de los modelos sociomicrobiológicos32, ya que depende en gran medida del entorno específico in vivo, con una mayor formación de biopelículas de mutantes agr mediando una mayor resistencia a los mecanismos de inmunidad innata. De acuerdo con esta aparente importancia clave de la disfuncionalidad de Agr para la evasión inmune en un entorno de biopelícula, también encontramos recientemente, mediante el análisis de aislados secuenciales, que se desarrollan mutantes disfuncionales de Agr durante la PJI clínica humana40, una observación realizada posteriormente de forma similar en la fibrosis quística44 . En particular, en nuestro estudio anterior, las biopelículas clínicas estaban compuestas prácticamente en un 100 % por mutantes agr ("tramposos del quórum") en lugar de un equilibrio de bacterias Agr funcionales y disfuncionales como habría predicho el modelo sociomicrobiológico32. El hecho de que en este estudio clínico reciente, los pacientes estuvieran comúnmente bajo terapia con antibióticos nos llevó a investigar en el presente estudio, utilizando modelos animales de infección por biopelícula, si la terapia con antibióticos juega un papel en el desarrollo de biopelículas resistentes a los antibióticos a través de una posible estimulación de efectos de trampa de quórum.

Primero analizamos el desarrollo de mutantes disfuncionales de Agr bajo tratamiento con concentraciones subinhibitorias de antibióticos in vitro, utilizando el enfoque común para determinar la capacidad hemolítica como indicador de la disfuncionalidad de Agr32,39,41,45 (Fig. 1a). Usamos concentraciones de MIC de ¼ × para el planctónico y MIC de 5 × (planctónico) para el modo de crecimiento de biopelícula40. Estas concentraciones se eligieron porque produjeron una inhibición del crecimiento igualmente modesta en las condiciones de la configuración experimental (Fig. 1 complementaria). La vancomicina (Van), la levofloxacina (Lev) y la clindamicina (Cli) se eligieron como antibióticos para este experimento porque se usaron con mayor frecuencia para la IAP en nuestra clínica y porque también los habíamos usado en nuestro estudio anterior sobre la tolerancia a los antibióticos mediada por Agr. -biopelículas disfuncionales40. Utilizamos la cepa MRSA LAC (USA300) para nuestros experimentos, que hoy en día es una cepa estándar ampliamente utilizada en la investigación de patogénesis de S. aureus. Los aislamientos de USA300 son la causa más común de MRSA asociado a la comunidad y una de las principales causas de infecciones por MRSA asociadas a hospitales en los Estados Unidos46.

una configuración experimental. Para el crecimiento planctónico, se inocularon diariamente cultivos de S. aureus LAC en nuevos medios TSB a 1/200 de volumen durante 9 días. La levofloxacina (Lev), la vancomicina (Van) o la clindamicina (Cli) se suministraron a ¼ × MIC. Para el crecimiento de biopelículas, se inocularon cultivos de S. aureus LAC a 1/200 de volumen de precultivos en pocillos de placas de microtitulación que contenían 200 μl de TSBg cada uno y se cultivaron durante 48 h para formar una biopelícula. Luego, el sobrenadante se eliminó con cuidado y se dispensaron 200 μl de TSBg que contenía Lev, Van o Cli en los pozos a 5x MIC En los siguientes 9 días, cada 3 días, el sobrenadante antiguo se eliminó con cuidado y se reemplazó con TSBg fresco ( 200 μl) con los respectivos antibióticos. b, c Resultados del crecimiento planctónico (b) y biopelícula (c). La disfuncionalidad de Agr se evaluó mediante hemólisis en placas de agar de oveja. n = 3/grupo y punto de tiempo. Las barras de error muestran la media ± SD. El análisis estadístico se realiza mediante ANOVA de dos vías con pruebas posteriores de Dunnett frente a valores de control.

En este experimento, pasamos cultivos mediante la inoculación diaria de medios de crecimiento frescos con 1/200 del volumen de los cultivos en la configuración de modo planctónico. Para la configuración del biofilm, dado que los biofilms no se pueden transferir cuantitativamente, intercambiamos el sobrenadante encima de los biofilms cultivados en pocillos de placas de microtitulación cada tres días con medio de crecimiento fresco. Descubrimos que las concentraciones subinhibitorias aplicadas de antibióticos revelaron efectos significativos en el desarrollo de tramposos del quórum (Fig. 1b, c). Además, aunque las configuraciones experimentales planctónicas y de biopelículas son ciertamente difíciles de comparar directamente, estos efectos dependientes de antibióticos aparecieron antes (ya a los 3 frente a solo a los 6 días) y fueron más pronunciados (un aumento constante de ~50 % durante los 3 a 9 días). rango de tiempo de días) en la biopelícula que un modo planctónico de crecimiento.

Luego, procedimos a nuestro objetivo principal de analizar la trampa de quórum bajo tratamiento con antibióticos durante la infección experimental. Con ese fin, nuevamente utilizamos la cepa LAC (USA300) y modelos de infección en ratones de infección de piel subcutánea asociada y no asociada a biopelícula (Fig. 2a). Excepto por la inserción del dispositivo, estos dos modelos son muy similares y, por lo tanto, ofrecen la posibilidad de comparar el efecto de la participación del dispositivo (biopelícula). El tratamiento antibiótico se inició el día 6 postinfección (tanto en el modelo de absceso cutáneo como en el de infección del catéter) y se repitió otras dos veces cada 24 h, durante un total de 3 días, tras lo cual se contó la UFC. Para la investigación del impacto de los antibióticos, nos centramos en Van y Lev y utilizamos un régimen de dosis bajas correspondiente a ~1/8 de la dosis corregida por peso corporal del ratón sugerida para el tratamiento clínico de infecciones óseas y articulares47. Esto tenía la intención de imitar la situación que se encuentra con frecuencia durante el tratamiento de infecciones asociadas a dispositivos, donde la dosis aplicada es subinhibitoria debido a una mayor tolerancia a los antibióticos de las biopelículas asociadas a dispositivos, lo que resulta en la persistencia de la infección. El régimen de dosis baja también fue necesario debido a la comparación con la infección de la piel no asociada con el catéter, donde las dosis más altas habrían matado rápidamente a todas las bacterias.

una configuración experimental. Se utilizaron hembras de 6 a 8 semanas de edad C57BL/6. Para el tratamiento con antibióticos, los ratones recibieron antibióticos a partir del día 6 después de la infección (modelos de absceso cutáneo y catéter) cada 24 h durante 3 días hasta el final del experimento. Los controles no recibieron antibiótico. Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de 0,25 ml que contenían 0,3 mg ml-1 Van (3,75 mg kg-1) o dosis orales de 0,4 ml que contenían 0,04 mg ml-1 Lev (0,8 mg kg-1). Todos los ratones en un tipo de infección se infectaron con las mismas CFU (absceso de la piel, ~1 × 107 CFU; infección del catéter, 1 × 103–104 CFU con el número real de bacterias adherentes analizadas). b, c Resultados obtenidos con infección por S. aureus LAC de tipo salvaje con y sin antibióticos. d, e Resultados obtenidos con la infección por S. aureus LAC de tipo salvaje versus mutante Δagr isogénico. f, g Resultados obtenidos con infección por S. aureus LAC Δagr con y sin antibióticos. n = 6 (b, d, f); n = 8 (c, e, g). h Piezas de catéter representativas infectadas o de control (sin infección) teñidas con PI o WGA-Alexa FluorTM 350. El análisis estadístico es ANOVA de 1 vía (b, f) o Kruskal-Wallis (c, g), con pruebas posteriores de Dunnett versus datos obtenido con control de tipo salvaje, prueba de Mann-Whitney ( d ) y prueba t de dos colas no pareada ( e ). Se eligieron pruebas paramétricas versus no paramétricas en base a pruebas de distribución normal (Shapiro-Wilk) para los datos en las respectivas comparaciones. Las barras de error muestran la media geométrica y la SD geométrica.

Según lo previsto, el tratamiento con Van o Lev solo redujo levemente y no significativamente las CFU en el modelo de absceso cutáneo (Fig. 2b). Por el contrario, en el modelo de catéter subcutáneo asociado a biopelícula, la CFU aumentó con la adición de antibióticos, lo que fue significativo para Lev (Fig. 2c). Con la hipótesis de que las razones subyacentes estaban asociadas con el engaño del quórum y su efecto sobre la resistencia mediada por biopelículas, primero determinamos el comportamiento de un mutante QS (Δagr) isogénico construido versus LAC de tipo salvaje. De acuerdo con lo que mostramos anteriormente32, el mutante Δagr había disminuido fuerte y significativamente la infectividad en el modelo de absceso cutáneo (Fig. 2d), como se esperaba del control por parte de Agr de varios factores de virulencia que se sabe que son cruciales en ese entorno, como como PSM o α-toxina48,49. Por el contrario, la cepa Δagr mostró una infectividad significativamente mayor que la cepa de tipo salvaje en el modelo de infección del catéter asociado a biopelícula (Fig. 2e). En el modelo de absceso cutáneo, tanto el tratamiento con Van como con Lev condujeron a una reducción significativa de las CFU (Fig. 2f), lo que indica que la resistencia in vivo a las concentraciones de antibiótico utilizadas está fuertemente disminuida en la cepa Δagr, una consecuencia probable de la capacidad de supervivencia bacteriana fuertemente disminuida. que se asocian con la disfuncionalidad de Agr en ese entorno32,49. En particular, el aumento significativo de CFU en el modelo de infección del catéter asociado a biopelículas que observamos con el tratamiento con antibióticos y la infección por S. aureus de tipo salvaje no se observó con la cepa isogénica Δagr (Fig. 2g), lo que sugiere que la detección de quórum de Agr es causalmente relacionado con este fenómeno. También teñimos los catéteres con PI o WGA-Alexa FluorTM 350, que tiñen el ADN extracelular del biofilm o el polisacárido, respectivamente, lo que confirma que los antibióticos aumentaron la formación de biofilm en el LAC pero no en los animales infectados con Δagr (Fig. 2h).

El experimento de corta duración (6 más 3 días) se eligió para poder compararlo directamente con una infección cutánea no asociada a biopelículas, en la que los fenotipos relacionados con la patogenia aparecen de forma temprana. Sin embargo, debido a que los efectos en el modelo de infección del catéter no fueron muy pronunciados a los 9 (6 más 3) días posteriores a la infección, y solo alcanzaron significación para Lev en la importante comparación que se muestra en la Fig. 2c, realizamos un experimento adicional de infección del catéter en el que prolongó la infección y tomó muestras a los 6 más 1, 3 o 9 días para obtener datos dependientes del tiempo (Fig. 3a). El fenómeno de aumento de la infectividad bajo el tratamiento con antibióticos se desarrolló con el tiempo, alcanzando significación a los 3 y 9 días para Lev y a los 9 días para Van, pero estuvo completamente ausente en los ratones infectados con Δagr en lugar de S. aureus de tipo salvaje (Fig. 3b,c).

una configuración experimental. A los ratones se les implantaron catéteres con 1 × 103–104 UFC bacterianas adherentes y recibieron inyecciones intraperitoneales de 0,25 ml que contenían 0,3 mg ml−1 Van (3,75 mg kg−1) o dosis orales de 0,4 ml que contenían 0,04 mg ml−1 Lev (0,8 mg kg−1) diariamente durante 9 días después de la infección. Los controles no recibieron antibiótico. Se sacrificaron diferentes grupos de ratones (n = 6/grupo) los días 1, 3 o 9 después del inicio del tratamiento con antibióticos. b, c UFC en los catéteres en los diferentes grupos después de la eutanasia. El análisis estadístico se realiza mediante pruebas de Mann-Whitney. Las barras de error muestran la media geométrica y la SD geométrica. d, e La disfuncionalidad de Agr (QS) se evaluó mediante hemólisis en placas de agar de oveja. El análisis estadístico se realiza mediante la prueba exacta de Fisher en cada punto de tiempo basado en los datos sin procesar subyacentes (fenotipo de hemólisis) de los clones analizados.

Además, utilizamos un modelo adicional de infección asociada a biopelícula, un modelo de PJI, para corroborar nuestros resultados obtenidos en el modelo de infección del catéter (Fig. 4a). En este modelo, también observamos un aumento significativo de CFU en Δagr en comparación con los animales infectados con LAC y un aumento de CFU en LAC pero no en animales infectados con Δagr bajo tratamiento con antibióticos (alcanzando significación estadística con Lev) (Fig. 4b-d).

Si nuestra hipótesis es correcta de que la disfuncionalidad de QS subyace al aumento de la infectividad observado bajo el tratamiento con antibióticos en los modelos asociados con biopelículas, esperamos detectar el desarrollo de tramposos de quórum durante la infección con S. aureus de tipo salvaje. Para confirmar esta hipótesis, determinamos la capacidad hemolítica de los aislamientos como lectura de la funcionalidad de Agr al final de la infección. Si bien no se detectaron mutantes disfuncionales de Agr en infecciones de la piel no asociadas con catéter (sin biopelícula) bajo ninguna condición, se desarrollaron en una infección asociada con catéter (biopelícula) a tasas significativamente más altas (Tabla 1). Es importante destacar que la tasa de desarrollo de mutantes disfuncionales Agr en la infección asociada al catéter aumentó aún más significativamente con el tratamiento con Lev o Van. Se hicieron observaciones similares en el modelo PJI, donde no se observaron mutantes Agr-disfuncionales sin, pero a tasas significativas con tratamiento con Lev o Van (Tabla 1). Se confirmó mediante secuenciación de ADN que todos los clones no hemolíticos interpretados como mutantes agr albergaban mutaciones no sinónimas en el sistema Agr (Tablas 2 y 3). Como se informó anteriormente para las mutaciones agr que ocurren in vitro o in vivo32,40,41, las mutaciones se asignan a los genes agrA o agrC. Curiosamente, detectamos con frecuencia la misma mutación en dos o más aislamientos de un ratón, lo que indica la proliferación de clones con mutación agr. Finalmente, mientras que el porcentaje de mutantes QS después de 6 más 3 días de intervención aún era bajo, es importante enfatizar que en nuestro modelo de intervención antibiótica de tiempo extendido, el porcentaje de mutantes QS que se detectaron después de 6 más 9 días fue sustancial ( Lev > 10%; Van > 2% de toda la población) (Fig. 3d, e). Los modelos de infección asociada a biopelícula de ratón apenas pueden extenderse más porque las infecciones se curan. No obstante, estos datos indican que los mutantes QS pueden desarrollarse y proliferar sustancialmente durante el tratamiento antibiótico de la infección asociada a biopelículas. Debido a que los fenotipos de biopelícula que observamos con antibióticos en dosis bajas teóricamente también pueden deberse a la expresión reducida de Agr en esas condiciones, analizamos si el tratamiento con antibióticos en dosis bajas conduce a cambios en la expresión de Agr. Si bien es difícil estimar las concentraciones in vivo reales en el sitio de infección del biofilm, usamos las concentraciones de MIC de 5x que habíamos empleado en el experimento in vitro que se muestra en la Fig. 1c para ese propósito. Creemos que la inhibición moderada del crecimiento observada con esas concentraciones in vitro indica que son al menos tan altas como las encontradas in vivo porque no observamos inhibición del crecimiento in vivo con las concentraciones de antibiótico utilizadas en los puntos de tiempo iniciales de 1 día. No hubo inhibición de la expresión de agr, medida por qRT-PCR del gen agrA, por MIC 5x de Lev, Van o Cli (Fig. 2 complementaria). Para los tres antibióticos, la expresión de agr, de hecho, aumentó bastante.

En conjunto, nuestros hallazgos muestran que el tratamiento con antibióticos puede exacerbar la infección por S. aureus asociada al dispositivo y vincular mecánicamente este fenómeno con la mayor frecuencia de desarrollo y proliferación de biopelículas compuestas por mutantes disfuncionales Agr que exhiben una mayor resistencia a los antibióticos.

La capacidad excepcional de S. aureus y otros patógenos para colonizar dispositivos médicos permanentes y causar infecciones persistentes de biopelículas resistentes a los antibióticos se ha atribuido principalmente a la presencia de genes específicos, como los que codifican polisacáridos o proteínas de la matriz de biopelículas25,50,51. Si bien dichos factores asociados con el biofilm son ciertos requisitos previos para el inicio y la persistencia de la infección del biofilm, y el entorno de la infección también puede provocar cambios en su expresión52, trabajos recientes realizados en nuestros laboratorios y en otros lugares indican que la infección asociada con dispositivos es un proceso dinámico con adaptaciones genéticas que juegan un papel importante en el progreso de este tipo de infecciones. Específicamente, ahora se ha reconocido que las mutaciones en el sistema Agr QS definen las adaptaciones genéticas que se desarrollan durante y exacerban la infección asociada con el dispositivo S. aureus por su mayor propensión a formar biopelículas31,32,34,40,53,54, lo que explica el frecuente aislamiento de tales mutantes de estas infecciones34,39,41.

Debido a que las infecciones clínicas asociadas a dispositivos comúnmente progresan bajo el tratamiento con antibióticos, en este estudio, nuestro objetivo fue investigar directamente si el tratamiento con antibióticos puede afectar las infecciones asociadas a dispositivos al estimular potencialmente el engaño del quórum, es decir, estimular el aumento de mutantes agr. In vitro, los antibióticos condujeron a un desarrollo más temprano y más pronunciado de trampas de quórum en biopelículas que en el modo de crecimiento planctónico. Más importante aún, mostramos que un régimen de antibióticos en dosis bajas exacerbó la infección asociada al biofilm y se asoció con un aumento y proliferación concomitantes de mutantes agr.

Nuestros hallazgos son consistentes con un modelo (que se muestra en la Fig. 5) en el que el tratamiento con antibióticos promueve la persistencia de mutantes QS disfuncionales Agr que surgen espontáneamente durante la infección asociada al biofilm. Como han demostrado nuestras investigaciones previas32,40, las biopelículas compuestas de mutantes agr han aumentado la resistencia a los antibióticos y al ataque de los leucocitos; por lo tanto, es probable que el desarrollo de biopelículas disfuncionales Agr durante la infección clínica asociada a biopelículas se explique por la presión selectiva ejercida por una combinación de estos dos mecanismos.

Naturalmente, el S. aureus que coloniza la piel contamina el dispositivo médico permanente (que se muestra como un catéter subcutáneo, como ejemplo) durante la inserción. Se produce la colonización inicial del dispositivo por bacterias contaminantes. En algunas bacterias ocurren mutaciones espontáneas en el locus agr, que producen S. aureus disfuncional con Agr. Durante la infección prolongada bajo la presión selectiva de antibióticos (vancomicina, levofloxacina), los mutantes disfuncionales Agr superan a los miembros de tipo salvaje de la población. Como resultado, se forma una fuerte biopelícula que aumenta considerablemente la resistencia a los antibióticos y la resistencia al ataque de los leucocitos. Esto conduce a la exacerbación de la infección del dispositivo, que puede implicar bacteriemia y diseminación sistémica.

Estos hallazgos tienen importantes implicaciones clínicas. El mensaje más llamativo de nuestro estudio es que el tratamiento con antibióticos en concentraciones que no erradican la infección, que es el mismo problema que se encuentra en el caso de las infecciones asociadas con dispositivos, puede desencadenar el aumento de mutantes tramposos del quórum disfuncional Agr y, por lo tanto, exacerbar aún más la infección.

Nuestro estudio tiene limitaciones. Solo utilizamos antibióticos seleccionados para nuestro estudio. Sin embargo, creemos que nuestros resultados pueden generalizarse porque (i) los antibióticos que elegimos cubren los que se usan con frecuencia en la clínica, (ii) representan modos de acción completamente diferentes (síntesis de ADN, síntesis de la pared celular) y (iii) tolerancia a los antibióticos. por la formación de biopelículas se reconoce generalmente como no específica. Además, debido a los límites de cuánto tiempo se puede mantener la infección experimental asociada con biopelículas de ratón, no pudimos prolongar la infección hasta que se pudo observar la superación completa de los tramposos del quórum que vimos en la infección clínica crónica por biopelículas40. Sin embargo, dada la considerable expansión de los tramposos de quórum que observamos en el modelo de ratón durante 2 semanas de infección, creemos que es razonable suponer una mayor propagación hasta el punto observado en la infección humana a largo plazo. Además, el fuerte aumento bajo tratamiento con antibióticos, que representa el mensaje principal de este estudio, fue claramente visible durante el período de tiempo monitoreado. Finalmente, reconocemos que puede haber mecanismos adicionales no relacionados con la formación de biopelículas que faciliten la supervivencia de mutantes disfuncionales de Agr en infecciones persistentes, como la supervivencia intracelular en células huésped, que se ha relacionado con PSM55. Si bien la persistencia intracelular no se abordó en nuestro estudio, se ha relacionado con factores distintos de Agr, como variantes de colonias pequeñas o el regulador Rsp56,57, mutaciones asociadas con las cuales no se identificaron en nuestro estudio humano anterior que monitoreó las mutaciones que surgen durante la biopelícula. infección40.

S. aureus LAC (tipo de campo pulsado USA300) se obtuvo de NARSA (Network on Antimicrobial Resistance in S. aureus). El mutante agr isogénico de S. aureus USA300 LAC ha sido descrito previamente48. Todo el sistema agr se elimina en este mutante, que se ha producido a través de la transducción de fagos a partir de la cepa RN691158. Todas las cepas se almacenaron en caldo de soja tríptico (TSB y BD) suplementado con glicerol al 30 % a -80 °C. Para los precultivos, que se usaron para inocular cultivos principales en los diversos experimentos como se indica, las bacterias se cultivaron en placas de agar sólidas que contenían TSB durante ~24 h, de las cuales se usaron clones individuales para la inoculación. Los cultivos planctónicos se cultivaron en condiciones de agitación (200 rpm) en TSB y los cultivos de biopelículas en placas de microtitulación en TSBg (TSB más glucosa al 0,5 %) sin agitación. Todos los cultivos bacterianos se cultivaron a 37 °C.

De manera similar a varios estudios previos32,39,41,45, utilizamos la actividad hemolítica al sembrar en agar sangre de carnero como una lectura de la funcionalidad de Agr. Según se informa, la mayoría de los mutantes que pierden la capacidad hemolítica muestran mutaciones espontáneas en el sistema Agr32,39,41,45. En experimentos clave in vivo, secuenciamos los genes agrA y agrC de los clones no hemolíticos con los cebadores agrACforward (5′-GCTATACAGTGCATTTGCTAG-3′) y agrACreverse (5′-TCGCAGCTTATAGTACTTGTG-3′).

Para el modo de crecimiento planctónico, los cultivos se cultivaron en TSB durante 24 h en tubos de fondo redondo de 15 ml, y los cultivos frescos se inocularon todos los días durante 9 días usando 1/200 del volumen del cultivo anterior solo en TSB (control) o TSB. con levofloxacina (Lev), vancomicina (Van) o clindamicina (Cli) a ¼ de CIM. Las CIM determinadas para la cepa LAC frente a los antibióticos utilizados en este estudio fueron: 1 μg/ml (Van), 4 μg/ml (Lev) y 0,3 μg/ml (Cli). En los días 3, 6 y 9, las diluciones se sembraron en placas de agar con sangre de carnero y se evaluó la hemólisis después de la incubación durante la noche a 37 °C. Para el modo de crecimiento de biopelícula, se inocularon cultivos de S. aureus LAC a 1/200 de volumen de precultivos en pocillos de placas de microtitulación que contenían 200 μl de TSBg y se cultivaron durante 48 h para formar una biopelícula. Luego, se eliminó suavemente el sobrenadante y se dispensaron 200 μl de TSBg que contenía Lev, Van o Cli en los pocillos a 5x MIC. En los siguientes 9 días, cada 3 días, el sobrenadante antiguo se eliminó suavemente y se reemplazó con TSBg fresco (200 μl) con los antibióticos respectivos.

Las susceptibilidades antimicrobianas de los aislamientos se determinaron mediante el método de difusión en disco en agar Mueller-Hinton de acuerdo con las pautas del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). S. aureus ATCC29213 se utilizó como control de calidad.

El ARN total de S. aureus se extrajo con un reactivo de extracción de ARN (Takara RR047A), luego se sintetizó ADN complementario a partir del ARN total con el kit de reactivos RT (Takara, RR037A). La amplificación de la muestra de ADN complementario resultante se realizó con TB Green® Fast qPCR Mix (Takara, RR430A). Se utilizó el detector de secuencias 7500 (Applied Biosystems) para realizar reacciones en placas de reacción MicroAmp Optical de 96 pocillos. Los oligonucleótidos utilizados fueron los siguientes (5′–3′): gyrB-F, CAAATGATCACAGCATTTGGTACAG, gyrB-R, CGGCATCAGTCATAATGACGAT, agrA-F, GCACATACACGCTTACAATTATTA, agr-R, ACACTGAATTACTGCCACGTTTTAA.

Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 de JSJ Corp. (introducidos originalmente de Jackson Laboratory) y se usaron para todos los experimentos con ratones. Todos los ratones tenían entre 6 y 8 semanas de edad en el momento del uso. Todos los animales fueron sacrificados por CO2 al final de los estudios. En los experimentos de tratamiento con antibióticos, los ratones recibieron antibióticos cada 24 h a partir del día 6 después de la infección (modelos de infección de catéter y piel) o el día 14 después de la infección (PJI) cada 24 h hasta el final del experimento. Los controles no recibieron antibiótico. Van y Lev se disolvieron en agua a una concentración de 0,3 mg ml-1 o 0,04 mg ml-1, respectivamente, y las soluciones se esterilizaron por filtración. Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de 0,25 ml que contenían 0,3 mg ml-1 Van (3,75 mg kg-1) o dosis orales de 0,4 ml que contenían 0,04 mg ml-1 Lev (0,8 mg kg-1). Los investigadores estaban cegados a la asignación de grupos cuando determinaron las UFC.

Modelo de absceso cutáneo. Aproximadamente 1 × 107 CFU de bacterias en 50 μl de PBS se inyectaron por vía subcutánea en el flanco izquierdo y/o derecho de ratones afeitados. Para determinar la carga bacteriana, los abscesos del día 9 se extirparon quirúrgicamente, se cortaron en trozos pequeños y se dividieron en cuatro tubos separados que contenían 500 mg de perlas de vidrio de borosilicato y 500 μl de PBS estéril. Las piezas de piel se homogeneizaron en un homogeneizador FastPrep 96 (MP Bio), 5 × 1 min a 1800 rpm. Luego, los homogeneizados se colocaron en placas, se incubaron a 37 °C durante 24 h y se enumeraron.

Modelo de infección de catéter. El modelo de infección del catéter se realizó esencialmente como se describió previamente32. Brevemente, se cubrieron piezas de catéter de 1 cm (catéteres Surflo® Teflon iv, 14 × 2") con igual número de bacterias. La adherencia se probó en experimentos de control y estuvo en el mismo rango (~ 1 × 103–104). Los catéteres se luego se insertó debajo de la piel dorsal de los ratones. Los catéteres se retiraron con cuidado de la piel los días 7, 9 y 15 después de la infección, y las CFU en los catéteres y el tejido directamente adyacente se determinaron mediante placas como se indicó anteriormente después de realizar un protocolo de sonicación validado para romper los aglomerados bacterianos en los catéteres y homogeneizar las muestras de tejido usando el homogeneizador FastPrep 96 (MP Bio), 5 × 1 min El protocolo de sonicación consistió en la sonicación de los catéteres recolectados durante 5 min en 1 ml de PBS en tubos de 2 ml en un Ultra Sonic Limpiador, seguido de agitación vorticial durante 15 min en un Vortex-Genie 2. Algunos catéteres obtenidos el día 9 después de la infección también se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % en PBS 0,1 M durante 30 min y luego se tiñeron con yoduro de propidio 10 μM (Yeasen, Shanghái) (tinción de ADN extracelular) durante 15 min o 2,5 μg/ml de aglutinina de germen de trigo (WGA)-Alexa FluorTM 350 (Invitrogen, W11263) (tinción de exopolisacárido de biopelícula estafilocócica) durante 20 min. A continuación, los catéteres teñidos se lavaron con PBS y se colocaron longitudinalmente en pocillos de una microplaca tratada con cultivo de tejido estéril de 96 pocillos con paredes de pocillo negras y un fondo de olefina cíclica ópticamente transparente y se tomaron imágenes con un microscopio automatizado Agilent BioTek Lionheart FX utilizando el canal confocal ( láser de 555 nm para el biofilm estafilocócico teñido con PI y láser de 350 nm para el biofilm estafilocócico teñido con WGA) con el objetivo 4x.

modelo PJI. Para el modelo PJI, los ratones se sometieron a la inserción de un implante tibial proximal unilateral con una aguja de jeringa de 10 mm de una jeringa de insulina BD de 1 ml (29 G × 1/2", 0,33 mm × 12,7 mm) utilizando una técnica quirúrgica descrita previamente59. inserción del implante a presión y cierre de la artrotomía, se utilizó una jeringa hermética a los gases (65 RN, Hamilton) para administrar una inyección intraarticular de bacterias de 50 μl con ~ 1 × 107 CFU. La dosificación inicial de CFU se verificó mediante inyecciones de jeringa paralelas colocados directamente por triplicado en placas de agar con sangre de oveja. El día 21 después de la infección, los ratones fueron sacrificados con CO2. Cada uno de los implantes tibiales unilaterales completos con la aguja de la jeringa y el tejido circundante directo se extrajeron y se determinaron las CFU mediante placas como se indicó anteriormente, después de realizando un protocolo de sonicación validado (ver arriba) para romper los aglomerados bacterianos en el implante tibial unilateral total y homogeneizando las muestras de tejido usando el homogeneizador FastPrep 96 (MP Bio), 5 × 1 min.

El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism versión 9.3.1 para Mac OS. Se utilizaron pruebas t de dos colas no pareadas o pruebas de Mann-Whitney para la comparación de dos grupos según los resultados de las pruebas de Shapiro-Wild para la normalidad de la distribución y ANOVA de 1 o 2 vías, o pruebas de Kruskal-Wallis. , según corresponda y en función de las pruebas de Shapiro-Wilk, para la comparación de más de dos grupos. Las pruebas específicas utilizadas se indican en las leyendas de las figuras. Para las escalas aritméticas, las barras de error representan la desviación estándar (SD) y las líneas representan la media. Para escalas logarítmicas, se representa la media geométrica con la SD geométrica. Todas las réplicas son independientes.

Las ilustraciones se realizaron con Biorender y Adobe Illustrator bajo licencias NIAID. Las imágenes del ratón son de Vecteezy.com.

Todo el trabajo con animales cumplió con todas las normas éticas pertinentes y fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Ren Ji, Facultad de Medicina, Universidad Jiao Tong de Shanghái, Shanghái, China (Número de aprobación: KY2021-225-B).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado o en los archivos de información complementaria. La cepa S. aureus LACΔagr está disponible del Dr. Min Li o del Dr. Michael Otto sujeto a un acuerdo de transferencia simple.

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Financiamiento: Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [Grant nos. 82272395 y 81974311 (a LH), 81873957 y 82172325 (a ML), 81772364 (a HS)], el Programa Shanghai Pujiang [número de subvención 2019PJD026 (a LH)], el Proyecto de Apoyo a la Investigación Científica de Orientación Médica de Shanghai Science and Technology Comisión [número de subvención 19411962600 (a HS)], y el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID), Institutos Nacionales de Salud (NIH) de EE. UU. [número de proyecto ZIA AI001080 (a MO)]. Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación, el análisis y la interpretación de los datos, la redacción del informe o la decisión de enviar el artículo para su publicación.

Departamento de Medicina de Laboratorio, Hospital Ren Ji, Escuela de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai, 160 Pujian Road, Shanghai, 200127, China

Lei He, Huiying Lv, Yanan Wang, Qian Liu, Hua Wang y Min Li

Departamento de Ortopedia, Sexto Hospital Popular afiliado a la Universidad Jiao Tong de Shanghái, 600 Yishan Road, Shanghái, 200233, China

Feng Jiang, Feiyang Zhang y Hao Shen

Sección de Genética Molecular de Patógenos, Laboratorio de Bacteriología, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., 50 South Drive, Bethesda, MD, 20814, EE. UU.

miguel otto

Facultad de Ciencias del Laboratorio Médico, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai, 227 South Chongqing Road, Shanghai, 200025, China

min-li

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Conceptualización: MO Metodología: LH, MO y ML Investigación: LH, HL, YW, FJ, QL, FZ y HW Visualización: LH y MO Adquisición de fondos: LH, HS, ML y MO Supervisión: LH, HS y ML Redacción: borrador original: LH y MO Redacción: revisión y edición: LH, ML y MO

Correspondencia a Michael Otto o Min Li.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Él, L., Lv, H., Wang, Y. et al. El tratamiento con antibióticos puede exacerbar la infección asociada a biopelículas al promover el desarrollo de tramposos de quórum. npj Biofilms Microbiomas 9, 26 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00394-4

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Recibido: 06 febrero 2023

Aceptado: 27 de abril de 2023

Publicado: 18 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00394-4

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